，如靶启动片段内的16、20或 更多个核苷酸。另外，这种片段通常包含与待测靶序列临近的已知序列片段互补的序列。
[0133] 如图10所示，第一扩增引物1000变性后可与靶核酸区段1010杂交。在某些情况 下，引物1000的构型可在这样的条件下变性，即，该条件还能使其与靶序列1010退火。在其 他情况下，引物的结构允许其杂交和启动靶片段1010,即使引物处于其发卡结构内，例如， 没有变性。
[0134] 例如，如图所示，在步骤A中，反应混合物被加热到适合第一扩增引物1000变性的 温度，例如37°c，使引物与靶片段1010退火。如图所示，然后对靶片段1010进行等温扩增 (步骤A和B)以制备更多的包含附着在其每一个末端上的第一扩增引物的发夹结构的可扩 增靶片段（步骤C中的片段1012)。值得注意的是，虽然图10中是以单线的方式描述的，但 是应当理解的是，为了便于讨论，用于描述靶片段1010和可扩增靶片段1012的单线代表互 补核酸的正义链和反义链中的任何一个或两个。
[0135] 对这个片段进行几何扩增，例如，PCR，利用与初始扩增引物序列1000互补的第二 扩增引物1014,例如，与1002、1004、1006、甚至1008或其互补序列中的一个或多个互补的 引物，得到扩增产物，例如，互补的模板片段1016和1018。扩增出片段1012以后（步骤E)， 扩增产物内原来的第一扩增引物片段或者部分重叠的等温或PCR扩增引物片段或其互补 序列如1016退火后在扩增产物的两个末端形成发卡结构（步骤E)，形成了部分双链的部 分毗连核酸区段1020。然后通过使部分双链区段自身启动向3'延伸将这些部分双链区段 1020转化（步骤F和G)成完全连续片段1022,例如，利用非链置换核酸聚合酶如克列诺片 段，然后通过连接酶处理使产生的3'末端连接到5'末端上。连接以后，用外切酶处理扩增 混合物以去除不是完全连续的所有核酸区段，例如，没有连接的或没有延伸完全的片段。
[0136] 虽然本发明的构建物主要或者优选直接作为模板如测序模板来描述的，但是应当 理解的是，这些结构也可以用作制备模板的中间结构，以提供与这种构建物一致的序列丰 余度。例如，本文所述的环状结构的核酸区段可用作滚环复制的模板以制备连体分子，这种 连体分子包含环状核酸内所携带的原始双链区段正义链和反义链的重复拷贝。这些复制出 的产物可直接作为模板分子用于模板依赖的测序过程，如本文其他地方所述（也可参见美 国专利系列号7, 476, 503,本文已完整纳入作为参考）。同样，也可以利用上述方法通过复 制过程制备环状构建物的多个拷贝（参见，例如，美国专利申请系列号61/072, 160,本文已 完整纳入作为参考）。
[0137] 用于制备本发明的模板构建物的双链核酸区段的制备可通过多种方式完成。例 如，通过已知的片段化方法如下文所述的方法将待分析样品来源的核酸区段化成双链区 段。另外，也可以通过双向扩增较大序列内的待测序列片段从样品核酸区段的靶区域制备 双链模板。具体地说，可以利用待测序列区两侧的序列特异性PCR引物扩增引物结合的区， 如通过单独的反向扩增或者结合初始线性扩增过程。得到的扩增产物包含目的双链序列 区，然后通过其他过程制备本发明的模板构建物。
[0138] 如上所述，利用本文所述的方法制备的本发明的模板核酸，例如，用于单分子测 序反应中，可来源于基因组DNA。基因组DNA可通过三个步骤从任何资源中制备：细胞 裂解、去蛋白化和回收DNA。这些步骤能够符合应用的要求，能够达到需要的DNA产量、 纯度和分子量以及资源的量和历史。有关基因组DNA分离的详细描述可参见Berger和 Ki_el，"分子克隆技术指南"《酶学方法》（Guide to Molecular Cloning Techniques， Methods in Enzymology)第 152 卷，学术出版社（Academic Press，Inc.)，圣地亚哥，加 州（Berger) ;Sambrook 等，《分子克隆：实验室手册》（Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第 3 版），1-3 卷，冷泉港实验室（Cold Spring Harbor Laboratory，冷泉港，纽 约，2000( "Sambrook"）；《新编分子生物学实验指南》（Current Protocols in Molecular Biology)，F. M. Ausubel 等编辑，《新编实验指南》（Current Protocols)，GPA 公司（Greene Publishing Associates，Inc.)和约翰威利父子公司（John Wiley&Sons，Inc.)之间的 临时合作（"Ausubel"））；Kaufman等，（2003)《生物学和医学中的分子和细胞方法手 册》（Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine)，第 二版，Ceske (编辑），CRC出版社（CRC Press) (Kaufman);以及《核酸方法学手册》（The Nucleic Acid Protocols Handbook)，Ralph Rapley(编辑）（2000)冷泉港，Humana 出 版社（Rapley)。另外，许多商品化的试剂盒也可用于从细胞中纯化基因组DNA，其中包括 Promega 的 Wizard? 基因组 DNA 纯化试剂盒（Genomic DNA Purification Kit)、BioRad 的 Aqua Pure?基因组 DNA 分离试剂盒（Aqua Pure? Genomic DNA Isolation Kit)、 Invitrogen 的 Easy-DNA?试剂盒（Easy-DNA? Kit);以及 Qiagen 的 DnEasy?组织试剂盒 (DnEasy? Tissue Kit)。另外，靶核酸区段也可以通过靶向捕获方法获取，其中靶核酸首先 以单链区段的形式被捕获在微阵列或其他捕获技术上，然后通过扩增捕获的材料来制备双 链样品材料。下列文献中描述了许多这样的捕获方法，例如，Hodges E等，Nat. Genet. 2007 年 11月 4 日；Olson M·，Nature Methods 2007年 11月，4(11) :891-2 ;Albert TJ等，Nature Methods 2007 年 11 月，4(11) :903-5 以及 Okou DT 等，Nature Methods 2007 年 11 月， 4(11):907-9〇
[0139] 可利用本文所述的方法制备的核酸，例如，用于高通量测序系统中，还可以来源于 cDNA，例如，从真核对象或者真核对象特殊组织的mRNA中制备的cDNA。通过测得来源于 cDNA文库的核酸模板的序列而得到的数据，例如，使用高通量测序系统，可用于鉴定，例如， 目的基因的新型剪接变体，或者用于比较，例如，目的基因剪接异构体的差异表达，例如，不 同组织类型之间、对同一类型的组织进行的不同处理之间或者同一类型的组织的不同发育 阶段之间的差异表达。
[0140] -般来说，利用，例如，Sambrook和Ausubel描述的方法几乎可以从任何资源中 分离mRNA。分离出的mRNA的产量和质量受如下因素影响，例如，提取RNA之前组织是如 何储存的，提取RNA期间通过何种方式破碎组织，或者从中提取RNA的组织的类型。相 应地可以优化RNA分离方法。现在有许多商品化的mRNA分离试剂盒，例如，mRNA-ONLY? 原核mRNA分离试剂盒和mRNA-〇NLY?真核mRNA分离试剂盒（mRNA-ONLY ?Prokaryotic mRNA Isolation Kit and the mRNA-〇NLY?Eukaryotic mRNA Isolation Kit) (Epicentre Biotechnologies)、FastTrack 2. OmRNA分离试剂盒（FastTrack 2. OmRNA Isolation Kit) (Invitrogen)以及 Easy-mRNA 试剂盒（Easy-mRNA Kit) (BioChain)。另外，各种物种如牛、 小鼠和人以及组织如脑、血液和心脏的mRNA已经成为商品，例如，BioChain (Hayward，CA)、 Ambion (Austin, TX)以及 Clontech (Mountainview，CA) 〇
[0141] 回收了纯化的mRNA以后就可以利用反转录酶从mRNA模板制备cDNA。从mRNA 制备cDNA的方法和方案，例如，从原核细胞以及生物细胞中收获的mRNA，可见于《cDNA文 库方案》（cDNA Library Protocols)，I.G. Cowell 等编辑，Humana Press，New Jersey， 1997，Sambrook和Ausubel的描述。另外，有许多商品化的试剂盒可用于制备cDNA，其中 包括 Cells-t〇-cDNA?II 试剂盒（Cells-t〇-cDNA?II Kit) (Ambion)、RETROscript?试剂 盒（RETR0script?Kit) (Ambion)、CloneMiner?cDNA 文库构建试剂盒（CloneMiner?cDNA Library Construction Kit) (Invitrogen)以及通用 RiboClone* cDNA 合成系统 (Universal RiboClonek cDNA Synthesis System) (Promega)。许多公司如 Agencourt Bioscience和Clontech都提供cDNA合成服务。
[0142] 在本文所述的本发明的某些实施方式中，核酸区段制备自基因组DNA或cDNA。现 有多种方法可用于从基因组DNA、cDNA或DNA连体制备核酸区段。其中包括而不限于机械 方法，如超声破碎、机械剪切、雾化、水剪切等；化学方法，如用羟自由基、Cu(II):硫醇组合 物、叠氮盐等处理；酶学方法，如外切酶消化、限制性内切酶消化等；以及电化学裂解。这些 方法在Sambrook和Ausubel中有更详细的描述。
[0143] VIII.试剂盒和系统
[0144] 除了上述模板组合物以及制备和使用这种组合物的方法以外，本发明还提供了这 种方法和组合物的实施方式。
[0145] 例如，在某些实施方式中，本发明提供了用于制备和使用本发明的模板构建物的 试剂盒。第一种典型的试剂盒提供了用于制备本发明的模板构建物的材料和方法，如本文 其他地方所述。因此，试剂盒通常包括制备本文所述的模板构建物所需的那些材料，例如上 述各种模板制备过程所用的模板构建物。应当理解的是，根据模板构建物的特性以及所用 的方法的不同，试剂盒的内容物也是可以变化的。例如，如果使用与双链核酸区段末端相连 的发卡接头，本发明的试剂盒通常包含这种发卡接头以及合适的连接酶和用于将这种接头 连接到双链核酸游离末端上的方法，以及用于在连接前处理双链区段末端的任何处理酶， 例如，为了提高突出或平端核酸。如上所述，这种接头可包含突出片段以便于连接到双链区 段的互补突出末端上。这些突出末端可以是在双链区段上添加已知序列的结果，例如，来自 于限制性内切酶裂解、加尾过程等，可选的是，制备具有这些特征的模板所需的试剂也可以 包含在试剂盒内，或者另外购买。
[0146] 在其他实施方式中，这些试剂盒包含引物或其他序列接头或序列延伸试剂，用于 提供突出端，这些突出端可用于提供双链核酸区段两条链之间的连接寡核苷酸。在某些情 况下，这些试剂盒可包含为连接寡核苷酸提供5'磷酸基团所需的酶系统，或者提供已经预 加上这种5'磷酸基团的扩增引物。这种引物还可包含上述第五碱基构型，用于控制扩增进 程以及在测序过程中使用得到的模板。
[0147] 第二种典型的试剂盒所提供的材料和方法不仅可用于制备本发明的模板构建物， 而且还可用于在对靶核酸序列进行序列分析时使用这种模板。因此，除了上述材料和方法 以外，这种试剂盒还包括用于这种测序过程的试剂，如用于启动测序过程的引物序列、聚合 酶，以及在优选例子中，提供光束缚核酸合成复合物所需的底物。在特别优选的方面，这种 底物通常包含一个或多个阵列的零模式波导管。这种波导管阵列还要经过进一步的表面处 理以使合成复合体局域化在这种零模式波导管的光照空间内，例如，已公开的国际专利申 请号WO 2007/123763所描述的，本文已完整纳入作为参考。另外，可选的是这种试剂盒还 可以包含用于测序的核苷酸组合物，其中包括，例如包含荧光的或其他可检测标记基团的 标记核苷酸，这些标记基团被连接到核苷多核酸构建物的除α磷酸之外的其他磷酸基团 上。本领域熟知的其他多种类型的标记的和非标记的核苷酸也可以包含在试剂盒中。
[0148] 本发明还提供了配合本发明的模板构建物一起使用的系统，用于分析靶核酸分 子。具体地说，这种系统通常包括本文所述的试剂系统以及用于检测那些试剂系统所产生 的序列信息的分析系统。例如，根据所用的测序过程性质的不同，测序系统可包含为了配合 商品化核酸测序系统的使用而提供或销售的系统组分，如Illumina，Inc.的基因组分析系 统（Genome Analyzer System)、454Life Science 的 GS FLX 系统（GS FLX System)或者生 命科技公司（Life Technologies, Inc.)的 ABI 3730 系统（ABI 3730System) 〇
[0149] 在优选的方面，这种系统包括能够解析各个测序复合体产生的荧光信号的荧光显 微镜。在特别优选的方面，这种系统包括反应区的阵列，例如，零模式波导管阵列，由系统来 提供光信号，用于检测其中产生的荧光信号，配合每一个ZMW内执行的测序反应。
[0150] 本发明的系统通常还包括与系统的检测部分可操控地连接的信息处理器或计算 机，用于储存系统产生的信号数据（例如，测序反应在掺入标记的核苷酸时经过系统的光 照可以产生荧光信号，说明有这种掺入发生），这些数据可得自检测器对计算机可读取介质 如硬盘、CD、DVD或其他光学介质、闪存等的读取。为了本发明的这个方面，需要提供这种可 操控连接以使检测系统检测到的数据转移到处理器内进行随后的分析和转化。可操控连接 可通过大家熟知的各种计算机网络或连接方法实现，例如，Firewire?、USB连接、无线连接 /WAN或LAN连接，或者能够实现数据高速转移的其他连接方式。一般来说，计算机还包括软 件，用于分析原始信号数据、鉴定与掺入事件可能相关的信号脉冲以及鉴定测序反应中掺 入的碱基，以便于将原始信号数据转化成用户可以解释的序列数据（参见，例如，已公开的 美国专利申请系列号2009-0024331，本文已完整纳入作为参考）。
[0151] 有关典型系统的详细描述可参见，例如，美国专利申请系列号11/901，273,申请日 2007年9月14日和美国专利申请系列号12/134, 186,申请日2008年6月5日，本文已完 整纳入作为参考。 IX.实施例
[0152] 本文所述的模板构建物可应用于下文详细描述的各种测序用途中。
[0153] 实施例1 :模板构建和测序
[0154] 本发明的模板构建物可用于通过掺入进行测序的过程中。具体地说，对模板进行 单分子实时（SMRT tm)测序，其中可监测引物序列的聚合酶介导的模板依赖的延伸，因为标 记的核苷酸类似物被掺入到新生链内。
[0155] 樽板构律物：
[0156] 利用引物 5 ' -GTACGGGTCTCACCCGGGGATCCTCTAGAATCGAT-3 ' 和 5 ' -CCTAAGGTCTCGG AAGCTACTAGTCCTCAGCAAGCTT-3'从质粒克隆中扩DNA双链片段。得到的产物用Zym〇-25PCR 纯化试剂盒（Zym〇-25PCR purification kit)纯化。通过在限制性内切酶BsaI (NEB)存 在的条件下孵育过夜在PCR产物的每一个末端制备突出端。消化后的产物用Qiagen PCR 纯化试剂盒（Qiagen PCR purification kit)纯化，然后连接到合成的发卡寡核苷酸上： 5' -CGGGCTCGGAACGAAAGTTCCGAG-3，和 5' -CTTCGGTCGCCAGATTAGAAAATCAGTCACGTCTAGATG CAGTCAGGTTCTTAAATCCTAGTTCCTTGGCGACC-3'。在存在 T4DNA 连接酶（NEB)的条件下，使消 化后的PCR产物与2倍过量的各种发卡寡