和五倍三氯甲烷搅拌升温浓缩，80°C前回收三氯甲烷，80°C以后回收甲苯，剩一定量是再加同样的混合溶媒反复升温回收三次后取样检测合格后离心并回收母液，离心物烘干后即得霉菌氧化物精品。
[0025]对本发明提出的黑根霉菌株，就其菌株培养基、培养条件和摇床验证(对沃氏氧化物发酵转化为霉菌氧化物)整个过程，进行了 4个实例验证:
实例I
在摇床转速175r/min，培养温度27°C，发酵时间40h的条件下，收率为100%，转化率为60.86%
实例2
在摇床转速185r/min，培养温度28°C，发酵时间48h的条件下，收率为105%，转化率为69.36%ο
[0026]实例3
在摇床转速190r/min，培养温度29°C，发酵时间56h的条件下，收率为105%，转化率为67.74%ο
[0027]实例4
在摇床转速200r/min，培养温度30°C，发酵时间60h的条件下，收率为100%，转化率为64.67%。
[0028]其结果表明:在培养基和培养条件(摇床转速、培养温度和培养时间)做相应变动的条件下，黑根霉菌株对沃氏氧化物的转化率和霉菌氧化物的收率分别稳定在100?105%和60?70%之间，说明本发明提出的黑根霉新型菌株具有优良的性状；而且其在大型生产规模上该菌株也具有较高的转化率和收率，其沃氏氧化物转化率为50?60%，霉菌氧化物(精品)收率为86?89%。
【主权项】
1.一种黑根霉菌株，属于真菌界，接合菌门，毛霉目，根霉科，菌种保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏时间为2013年06月08日，保藏号为:CGMCC N0.7687。2.一种权利要求1所述的黑根霉菌株CGMCC N0.7687在以沃氏氧化物为底物制备霉菌氧化物中的应用。3.一种权利要求1所述的黑根霉菌株CGMCC N0.7687在以沃氏氧化物为底物生产霉菌氧化物的方法，其特征在于包括以下步骤: ⑴原种复活:在原种生长温度条件下，在酵母膏琼脂培养基试管斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面并出现大量黑色分生孢子； ⑵制备菌悬液:取无菌水倒入培养好的试管斜面中，用接种针搅拌打下气生菌丝上的孢子制备成菌悬液，再取菌悬液稀释后，涂布在酵母膏琼脂培养基平板上，在生长温度条件下培养； ⑶制备试管斜面:在培养的酵母膏琼脂培养基平板上选择单个菌落接种在酵母膏琼脂培养基试管斜面上，在生长温度条件下培养； ⑷制备种子液:将试管斜面培养的菌种制备成菌悬液并移入已经灭菌的摇瓶培养液中，在生长温度条件下，在摇床上培养，获得种子液； (5)投料发酵:投入沃氏氧化物到种子液中摇瓶发酵培养，在菌种生长条件下，培养得到发酵液； (6)结果检测:将每个摇瓶的发酵液经“煮沸-抽滤-粉碎-加入丙酮蒸发-回流-再抽滤-浓缩-结晶”程序后，将结晶物抽滤得到粗制品和母液，将粗制品烘干称取粗制品重量，根据投料量计算粗制品收率和转化率； (7)选取生产菌株:在收率100%、转化率65%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株，一方面制成砂土管或者牛奶冻干管原种在4°C条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用，另一方面传代用于留体发酵生产； ⑶传代培养:在生长温度条件下，将选取的生产菌株接入酵母膏琼脂培养基试管斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面并产生黑色分生孢子； ⑶培养生产母种:将煮熟的小米盛入克氏瓶并灭菌冷却后，然后将传代培养后的斜面菌种制备成菌悬液后接入克氏瓶小米培养基中培养，使得气生菌丝长满克氏瓶并产生大量黑色孢子； (10)培养生产种子液:将生产母种接入30T发酵罐中，培养基与摇瓶培养液相同，在生长温度条件下培养，取样镜检确定没有被污染并且菌丝均匀、PH值在3.5以下，菌丝体体积在95%以上后即可压入底物溶液进行转化； (11)底物溶液制备:溶解罐中加入水，将沃氏氧化物投入其中，再加入洗衣粉，密闭后先升温，然后降温得到底物溶液备用； (12)投底物发酵:压入沃氏氧化物底物溶液，在生长温度下发酵培养后用氨水调节Ph值，然后根据取样检测当时的发酵罐中的转化情况决定发酵终止时间； (13)压滤:在发酵达到终止条件后对发酵罐内发酵液进行升温灭活，再降温后进行压滤，取滤饼打粉后备用； (14)滤饼粉提取:将滤饼粉投入提取罐，加入丙酮，升温后回流，然后压滤至浓缩罐进行浓缩，再打入丙酮循环回流、提取，直至滤饼提取干净； (15)粗制品浓缩:将上步的提取液浓缩至粥状物，加入NaOH和工艺用水，回收水丙酮； (16)粗制品离心:将上步溶液置入离心机离心甩干，用工艺用水洗涤至中性并用蒸汽进行除油；同时回收母液； (17)粗制品烘干:将上述粗制品放入烘箱，烘烤获得粗制品； (18)精制品:将粗制品投入精制罐，加入甲苯升温，保温，再降温后压滤，加入甲苯和三氯甲烷搅拌升温浓缩，分步回收三氯甲烷和甲苯，以同样方式反复回收，然后取样检测合格后离心并回收母液，离心物烘干后即得霉菌氧化物精品。4.按权利要求3所述的黑根霉菌株CGMCC N0.7687在以沃氏氧化物为底物生产霉菌氧化物的方法，其特征在于: 步骤⑴原种复活中使用温度为25?27°C ； 步骤⑵制备菌悬液中，稀释的菌悬液应涂布在直径为150mm的酵母膏琼脂培养基平板上，在25?27 °C温度条件下培养； 步骤⑶中，菌落接种试管斜面在25?27°C温度条件下培养； 步骤⑷中，种子液是在27?28°C温度条件下，以175?200转/分在摇床上培养20?22h获得； 步骤(5)中，沃氏氧化物的投料量为1.5?2.0wt%，培养时间48h ； 步骤⑶中，传代培养的温度为25?27°C，在培养基试管斜面上培养4?5天； 步骤⑶中，培养生产母种是在克氏瓶小米培养基中25?27°C条件下培养5?6天； 步骤(1Φ中生产种子液工序，生产母种应在发酵罐中27?28°C温度条件下培养21?23h ； 步骤(11)中，溶解罐中物料密闭后先升温至121°C保温，再降温至55°C ±2°C ; 步骤(12)中，投底物发酵:压入沃氏氧化物底物溶液，在27?29°C温度下发酵培养1h后用氨水调节pH值到4.0?4.5间，48?56h后根据取样检测； 步骤(13)中，升温灭活温度为80°C，再降温至55°C ±2°C进行压滤；步骤(14)中，提取罐中加入菌丝体重量8倍体积的丙酮，升温至55?65°C后回流20min ；步骤(15)中，加入NaOH和工艺用水后应升温至95?105°C并维持I?2h回收水丙酮；步骤(18)中，甲苯是粗品9倍体积并升温至90°C并保温lOmin，再降温至35°C后压滤，反复3次后加入I倍体积甲苯和5倍体积三氯甲烷搅拌升温浓缩，80°C前回收三氯甲烷，80°C以后回收甲苯，以同样方式反复回收3次。
【专利摘要】本发明属于工业真菌技术领域，具体设计一种高产甾体发酵黑根霉菌株及其甾体化合物发酵的应用技术。所述黑根霉菌株属于真菌界，接合菌门，毛霉目（Mucorales），根霉科。菌种保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏时间为2013年06月08日，保藏号为：CGMCC No.7687。本发明所述的黑根霉菌株，其用于甾体化合物（薯蓣皂甙）为原料生产植物激素的转化过程中，以甾体中间体沃氏氧化物为底物生产甾体中间体霉菌氧化物。其生产霉菌氧化物具有转化率高（60～71%）、收率高（100～105%），而且生物学性状比较稳定等特点，可以为以薯蓣皂甙为原料的植物甾体激素生产提高产量、降低生产成本提供技术支持。CGMCC No.768720130608
【IPC分类】C12R1/845, C12P1/02, C12N1/14
【公开号】CN104893982
【申请号】CN201410136456
【发明人】杨晓亮, 周德群, 赵月华, 王钱钢
【申请人】丽江映华生物药业有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年4月8日