至50并利 用标准方案通过其His标签纯化。将25ml静止过夜培养物（LB，1 %葡萄糖，100mg/l氨苄 青霉素的；37°C )用于接种到11培养物（相同的培养基）中。在600nm，吸光度为0. 7,用 0. 5mM IPTG诱导培养物并在37°C培养4-5h。将培养物离心并且将得到的团块重新悬浮在 40ml TBS500(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8)中并进行超声处理。将裂解产物离心并 且将甘油（终浓度10% (v/v))和咪唑（终浓度20mM)加入所得的上清液中。根据制造商 的指示（QIAgen，德国）在镍-氨次氮基三乙酸柱（2.5ml柱容积）上纯化蛋白。可代替 地，根据本领域技术人员已知的标准树脂和方案，通过阴离子交换色谱，接着通过体积排阻 色谱纯化缺乏6xHis标签的DARPin或选定的重复序列结构域。从SDS-15% PAGE估计，1 升大肠杆菌培养物可以纯化出高达200mg对HER2具有结合特异性的高度可溶的DARPin，并 且纯度>95%。这样纯化的DARPin用于进一步表征。
[0389] 实施例2 :通过表面等离子体共振分析表征对HER2具有结合特异性的DARPin
[0390] 通过表面等离子体共振（SPR)分析和ProteOn阵列系统（BioRad)检验纯化的、结 合HER2的感兴趣的DARPin的蛋白结合动力学，其中ProteOn阵列系统这样设置：通过中 和亲和素（neutravidin)固定生物素化的人HER2并且加入游离的单价DARPin测量相互作 用。根据标准程序确定Kd值。
[0391] 通过结合至涂布的链霉亲和素将生物素化的人HER2分子的胞外域固定在流动池 中，并且分析与各种选定的DARPin的相互作用。
[0392] 表面等离子体共振（SPR)分析
[0393] 利用ProteOn仪（BioRad)测量SPR并且根据本领域技术人员已知的标准程序进 行测量。运行缓冲液为PBS，pH 7. 4,其含有0. 005% Tween 20?。中和亲和素通过共价键固 定在GLC芯片（BioRad)上，达到约8000个共振单位（RU)的水平。接着，将HER2固定在涂 布中和亲和素的芯片上。然后，通过如下方式测量DARPin HER2的相互作用：注入100 μ 1 含连续稀释的0八1?^11(浓度为50、25、12.5、6.25和3.12511]\0的运行缓冲液（含有0.005% Tween?的PBS)(基于速率测量），接着，使运行缓冲液以100 μ Ι/min的恒定流速流动10 分钟至最多3小时（解离速率测量）。从注入HER2之后获得的RU踪迹（双参考）中去除未 涂布的参考细胞和参考注入物（即，仅注入运行缓冲液）的信号（即，共振单元（RU)值）。 从结合速率测量和解离速率测量获得的SRP踪迹可以确定相应的DARPin HER2相互作用的 结合速率和解离速率。
[0394] 表1总结了结果。利用本领域技术人员已知的标准程序由预计的结合速率和解离 速率计算解离常数（Kd)。
[0395] 表1:通过SPR确定的选定用于人HER2的DARPin的解离常数
[0396]
[0397] n.cL:未确定。
[0398] 实施例3 :绘制结合至特定的胞外HER2表位的重复序列结构域的图谱
[0399] 通过本领域技术人员已知的标准方法，分析重复序列结构域与胞外HER2结构域 的相互作用，比如，通过X射线结晶技术或NMR光谱法分析复合物四级结构，或利用潜在的 相互作用的残基的丙氨酸突变或利用质谱法和共价标记进行表位绘图。此外，进行本领域 从事者已知的各种竞争试验，比如竞争酶联免疫吸附试验（ELISA)以识别选定的重复序列 蛋白结合的胞外结构域或者其是否具有与其它结合蛋白（例如，抗体，比如曲妥珠单抗或 帕妥珠单抗）重叠的在HER2的胞外结构域上的表位。
[0400] HER2的胞外结构域通过购买得到或如（Jost等人，同上）所述制备得到。
[0401] 通过表面等离子体共振（SPR)分析和ProteOn阵列系统（BioRad)进行结合 HER2的、感兴趣的纯化的DARPin的竞争，ProteOn阵列系统使用如下设置：生物素化人 ErbB2S22-N530和ErbB2S22-E645通过中和亲和素固定，并且通过加入饱和状态（IuM)的第 一单价DARPin，接着加入第一和第二DARPin (各IOOuM)的1:1混合物，测量竞争。如果尽 管存在第一 DARPin，第二DARPin仍结合，则该第二DARPin被认为结合不同的表位。
[0402] 例如，竞争ELISA(图IA和1B)数据表明DARPin#54结合HER2的结构域II并且 DARPin#51结合HER2的结构域I。先前已表明DARPin#18结合至HER2的结构域IVCJost等 人，同上）。所述DARPins (20nM)与HER2域I，结构域I-III或域III-IV (在每种情况下结构 域浓度为500nm)在PBS中室温预培养45分钟。将混合物加入涂布在F96MaxiSorb Nunc (商 品目录号442404)板的20nM全长HER2中。使用小鼠抗RGS-His单克隆抗体（Qiagen，商品 目录号34650)作为第一抗体并且用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体（Pierce，商品目录 号31438)作为第二抗体特异性检测结合的DARPins。在图IB描述的ELISA中，第一抗体 (小鼠抗RGS-His单克隆抗体）被小鼠抗DARPin单克隆抗体代替。
[0403] 在450nm下进行读数。除了涂板（利用PBS，pH 7. 4在4°C过夜进行）之外，所有 的培养步骤在含有0.1%了￥661120(?和0.25%酪蛋白，口!17.4的？85中、450印111他丨(1〇1口11 Titramax 1000摇床上室温下进行2h。
[0404] 这些研宄结果得到了确认：通过流式细胞术（FACS)确定，这些DARPin已竞争结合 至具有HER2重组结构域I、结构域I-II-III和结构域III-IV的HER2过表达细胞（BT474)。 DARPins(IOOnM)与单独的Her2构建体（IuM)在25°C预培养30分钟。将混合物施加在细 胞（IOOul中100. 000个细胞）中，在冰上保持20分钟。利用Alexa 647标记的抗5-His 抗体（Qiagen商品目录号：35370)监测DARPin与细胞的结合。该试验确定DARPin#51结 合至HER2的结构域I，并且DARPin#l结合至HER2的II，DARPin#18结合至HER2的IV。
[0405] 还利用流式细胞仪测试DARPin#l与帕妥珠单抗和DARPin#18与曲妥珠单抗的竞 争。为此，在与各DARPin(IuM) -起培养之前，将BT474细胞分别与帕妥珠单抗、曲妥珠单 抗（两者都为IuM) -起培养。利用Alexa 647标记的抗5-His抗体（Qiagen商品目录号： 35370)监测DARPin与细胞的结合，并且利用Alexa 546标记的抗人-IgG抗体（Invitrogen 商品目录号：A-21089)监测帕妥珠单抗或曲妥珠单抗与细胞的结合。该实验展示了 DARPin 都不与帕妥珠单抗或曲妥珠单抗竞争结合至BT474细胞表达的HER2。
[0406] 也通过ELISA(图1C)观察该研宄结果，其中在与各DARPin(20nM) -起培养之 前，将帕妥珠单抗（以20nM涂布在F96 MaxiSorb Nunc (商品目录号442404)上）与20nM Her2(结构域I-IIII) 一起预培养。利用小鼠抗RGS-His单克隆抗体（Qiagen，商品目录号 34650)和辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体（Pierce,商品目录号31438)(在室温下预混 合45min)检测DARPin在HER2-帕妥珠单抗复合物上的特异性结合。除了涂板（在4°C过 夜进行）之外，所有的培养步骤在450rpm Heidolph Titramax 1000摇床上室温下进行2h。 PBS，0. 1 % Tween 20_? pH7. 4、0. 25 %酪蛋白用作阻断剂。在帕妥珠单抗存在的情况下，该试 验中测试的所有 N 端 DARPin (DARPin#7、DARPin#52、DARPin#53,和 DARPin#54)结合 HER2， 表明N端DARPin都结合与该抗体不同的表位。
[0407] 总的来说，这些实验表明SEQ ID NO:62至68、72,和114至121编码的单价重复序 列结构域结合至HER2的结构域II，SEQ ID NO:69-71、73、112和113编码的单价重复序列 结构域结合至HER2的结构域I，并且SEQ ID NO: 74至82编码的单价重复序列结构域结合 至HER2的结构域IV。结合至HER2的结构域II的单价重复序列结构域（SEQ ID NO:62至 68、72,和114至121)都不与帕妥珠单抗竞争结合至HER2。在结合至HER2的结构域IV的 单价重复序列结构域中，SEQ ID N0:77、78和82编码的重复序列结构域与曲妥珠单抗竞争 结合至HER2,而SEC ID NO: 74至76和79至81编码的重复序列结构域不与曲妥珠单抗竞 争。
[0408] 实施例4 :结合HER2的双特异性DARPin阻断过度表达HER2的肿瘤细胞的生长
[0409] 测试单价DARPiruDARPin的混合物和结合HER2的双特异性DARPin对BT474细胞 增殖的抑制。图2展示了单价DARPin和单价DARPin的混合物不能阻断BT474细胞增殖。 相反，双特异性DARPin分组诱导对增殖的抑制（图2,表2)。有趣的是，DARPin HER2的重 复序列结构域IV必须位于分子的C端（图2)。双特异性形式的单价DARPin的多个组合 导致对增殖有抑制作用的DARPin。但是并非所有的组合都能将阻断90-100 %的BT474增 殖（图3)，这使某些DARPin组合得以归类。这些研宄结果表明双特异性形式是有效实现靶 向不同分组的某些HER2表位的关键。通过曲妥珠单抗诱导HER2受体内在化和降解（据报 道）不足以诱导对肿瘤细胞增殖的有效抑制（图3和5)。与曲妥珠单抗类似，DARPin#41 和DARPin#43都能诱导HER2的降解，但仅有DARPin，比如DARPin#41抑制肿瘤细胞增殖。 [0410] 如方法部分所述进行实验。表2总结了实验结果。利用本领域技术人员已知的标 准程序由如上所述获得的滴定曲线计算IC5tl值。图2和3中给出了 DARPin#41的滴定曲线 例子。
[0411] 表2:各种DARPin对BTB474细胞增殖的抑制效力
[0412]
[0413] n. i.:未观察到抑制
[0414] 实施例5 :祀向HER2的双特异性DARPin抑制各种HER2过度表达的细胞系的增殖 并诱导凋亡
[0415] 测试双特异性DARPin#41的效力。在过度表达HER2的细胞系而非表达野生型HER2 水平的细胞中，该DARPin对增殖的抑制范围为Her2IHC 3+至1+(图4 ;表3)。此外，在所 列举的细胞系中，该DARPin在24h的培养中强劲地诱导凋亡（图5 ;表3)。
[0416] 如方法部分所述进行实验。表3总结了实施例结果。利用本领域技术人员已知的 标准程序由如上所述获得的滴定曲线计算IC 5tl和EC5tl值。图4和5中给出了 DARPin#41在 三个不同细胞系上的滴定曲线例子。取决于测试的DARPin和细胞系，IC5tl和EC 5Q值的范围 在 0· 2 - IOnM 之间。例如，实验表明 DARPin#41、#45 和 #46 在 BT474、MDA-MB175 和 NCI-N87 细胞中诱导凋亡（表3)。利用本发明的其它双特异性结合蛋白也获得相似的结果。
[0417] 表3 ::DARPin#41在各种不同的细胞系上的效力
[0419] n. a.:未分析
[0420] n. i.:无抑制
[0421] 实施例6 :与当前标准护理治疗对比，靶向HER2的双特异性DARPin抑制BT474细 胞的增殖并诱导凋亡
[0422] 比较双特异性DARPin#41的效力与批准用于治疗HER2阳性乳腺癌的药物、曲妥珠 单抗和帕妥珠单抗的效力。与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合 相比，该DARPin有效抑制增殖并且诱导凋亡。
[0423] 如方法部分所述进行实验。图6展示了实施例结果。利用本领域技术人员已知的 标准程序由如上所述获得的滴定曲线计算IC 5tl和EC 5Q值（表3)。利用本发明的其它双特 异性结合蛋白也获得相似的结果。
[0424] 实施例7 :各种DARPin形式的产生
[0425] 作为例子，比较不同形式的双特异性DARPin#41和DARPin#41抑制BT474细 胞增殖的效力（图7,表2)。N端或C端的聚乙二醇化或融合至结合人血清白蛋白的 DARPin(DARPin#41、#63、#64、#65)的行为不影响效力（图7A)。此外，DARPin部分之间的 接头的变化不影响效力（图7B)。IC5tl值范围在I. 5 - 5. 5nM之间。利用相应形式的双特异 性DARPin#41、#66、#67、#68获得相应的结果。总的来说，这清楚地表明可以（通过本领域 技术人员已知的方法，比如聚乙二醇化或融合至结合血清白蛋白的结构域）修饰该双特异 性DARPin以增加其体内半衰期而不损失效力。此外，这些实验表明，在双特异性构建体中 结合至HER2的两个重复序列结构域之间的接头可以在至少2至24个氨基酸之间变化而不 明显影响该双特异性构建体的功效。
[0426] 实施例8 :绘制DARPin/Her2相互作用图谱
[0427] 通过溶液（即，PBS，pH 7. 4)中这两种分子形成的复合物的化学交联，接着用蛋白 酶消化该复合物，并且通过质谱法分析得到的多肽，进一步分析本发明的双特异性DARPin 与HER2胞外域的相互作用。在这样的实验中，DARPin区域与HER2区域可以通过共价键交 联，只要其接近后者。通过质谱法分析对来自与HER2的相应多肽通过共价键交联的DARPin 的多肽的检测表明在HER2/DRAPin复合物中这些多肽很接近。本领域技术人员周知这些邻 近分析方法（例如，Birch, C.，等人，Anal. Chem.，82, 172 - 179, 2010)并且是各种公司提 供的服务（例如，CovalX AG, Zurich,瑞士）。
[0428] 例如，在这些实验中发现，双特异性DARPin#41 (其结合HER2的结构域II和结构 域IV)可以与HER2形成1 :1复合物。令人惊讶地，观察到C端重复序列结构域（结合至 HER2的结构域IV)和HER2的结构域I之间的共价交联，表明即使其结合至结构域IV，但该 重复序列结构域与在该复合物中的HER2结构域I接近。如果HER2的构象如现有技术（例 如，Bublil和Yarden,同上）所述，则预期不能看见这些交联。重要的是，分析HER2胞外 域与单独结合至结构域IV的C端重复序列结构域的复合，不能观察到这种与HER2的结构 域I的交联，表面在HER2和结合至结构域IV的单体重复序列结构域形成复合物的情况下， 该重复序列结构域不接近结构域I。因此，相比单独的重复序列结构域结合HER2的结构域 IV形成的复合物，与本发明的双特异性结合蛋白形成的复合物中，HER2的三维结构域排列 必然不同
[0429] 有趣的是，考虑到在2个重复序列结构域之间的短接头的范围为2至24个氨基 酸，HER2的胞外域的已知结构使本发明的双特异性结合蛋白的两个重复序列结构域不能同 时结合至相同的HER2分子。这表明HER2可能处于未知的构象中，从而能同时结合两个重 复序列结构域。
[0430] 总的来说，这些实验表明本发明的双特异性结合蛋白可以与HER2的胞外域在分 子内相互作用，并且因此本发明的双特异性结合蛋白使HER2胞外域处于现有技术未知的 新构象，即，使结构域I和结构域IV处于这样的空间排列：能够观察到重复序列结构域（结 合至HER2的结构域IV)和结构域I之间的交联。因此，这种HER2新构象看起来是由本发 明的双特异性结合蛋白以分子内的方式通过同时结合HER2的结构域II和结构域IV来稳 定。
【主权项】
1. 一种重组结合蛋白，其包含至少第一和第二重复序列结构域，其中该第一和第二重 复序列结构域中的每一个均结合至HER2的胞外区域，并且其中所述重复序列结构域通过 共价键连接。2. 根据权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，所述第一重复序列结构域结合HER2 的结构域II并且所述第二重复序列结构域结合ffiR2的结构域IV。3. 根据权利要求1-2中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述第一和第二重复 序列结构域位于相同的多肽上，并且其中靶向ffiR2的结构域II的重复序列结构域位于靶 向HER2的结构域IV的重复序列结构域的N端。4. 根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，结合HER2的结构域II的 所述第一重复序列结构域不与帕妥珠单抗竞争结合至HER2。5. 根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，结合HER2的结构域IV的 所述第二重复序列结构域不与曲妥珠单抗竞争结合至J1ER2。6. 根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，所述第一重复序列结构 域为锚蛋白重复序列结构域，并且所述第二重复序列结构域为锚蛋白重复序列结构域。7. 根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，所述第一重复序列结构 域以低于KT7M的Kd结合HER2的胞外区域，并且所述第二重复序列结构域以低于KT7M的 Kd结合HER2的胞外区域。8. 根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白以小于 IOOnM的IC5tl值抑制BT474的受激增殖。9. 根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白能以低于 IOOnM的EC5tl值诱导BT474细胞凋亡。10. 根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，所述第一和第二重复序 列结构域通过多肽接头连接。11. 根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于： 所述第一重复序列结构域与选自SEQIDNOs:62-68、72和114-121的锚蛋白重复序列 结构域竞争结合至J1ER2 ;和/或 所述第二重复序列结构域与选自SEQIDNOs:74-82的锚蛋白重复序列结构域竞争结 合至HER2。12. 根据权利要求10所述的结合蛋白，其特征在于： 所述第一重复序列结构域包含与选自SEQIDNOs:62-68、72和114-121的一个锚蛋白 重复序列结构域具有至少70%氨基酸序列一致性的氨基酸序列；和/或 所述第二重复序列结构域包含与选自SEQIDNOs:74-82的一个锚蛋白重复序列结构 域具有至少70%氨基酸序列一致性的氨基酸序列，并且其中进一步地， 在所述锚蛋白重复序列结构域的位置1的G和/或位置2的S可选地缺失；以及 在所述锚蛋白重复序列结构域的倒数第二位置的L和/或最后位置的N可选地被A替 换。13. 根据权利要求10至12中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于： 所述第一重复序列结构域选自SEQIDNOs:62-68、72和114-121的锚蛋白重复序列结 构域，和/或 所述第二重复序列结构域选自SEQIDN0s:74-82的锚蛋白重复序列结构域， 并且其中进一步地， 在所述锚蛋白重复序列结构域的位置1的G和/或位置2的S可选地缺失；以及 在所述锚蛋白重复序列结构域的倒数第二位置的L和/或最后位置的N可选地被A替 换。14. 根据权利要求10至13中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于，其中： 所述第一重复序列结构域包含锚蛋白重复序列模块，该锚蛋白重复序列模块具有选自SEQIDN0:15-18、21-23、37、38、125、126、129、130、133、134 的氨基酸序列，其中在SEQID N0:15-18、21-23、37、38、125、126、129、130、133、134中多达9个氨基酸被任何其它氨基酸 残基取代，和/或 所述第二重复序列结构域包含锚蛋白重复序列模块，该锚蛋白重复序列模块具有选自SEQID勵:46、47、51、52、55和56的氨基酸序列，其中在5￡0 1〇勵:46、47、51、52、55和56 中多达9个氨基酸被任何其它氨基酸残基取代。15. 根据权利要求10至14中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述锚蛋白重复 序列模块具有选自KDFQGITPLHIAATSGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQIDNO:16)的氨基酸序列， 其中在SEQIDNO: 16中多达9个氨基酸残基被任何其它氨基酸残基取代，并且其中 在位置3的F可选地被A替换； 在位置4的Q可选地被E替换； 在位置5的G可选地被S替换； 在位置6的I可选地被V替换； 在位置11的I可选地被L替换； 在位置14的T可选地被Q替换；和/或 在位置15的N可选地被选自S和W的氨基酸，最优选被S，替换。16. 根据权利要求10至14中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述锚蛋白重复 序列模块具有选自KDITGETPLHHAADSGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQIDN0:18)的氨基酸序列， 其中在SEQIDNO: 18中多达9个氨基酸残基被任何其它氨基酸残基取代，并且其中 在位置3的I可选地被V替换； 在位置6的E可选地被D替换； 在位置11的H可选地被L替换； 在位置14的D可选地被Q替换； 在位置15的S可选地被H替换；和/或 在位置19的E可选地被V替换。17. 根据权利要求10至15中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包 含多肽，所述多肽与选自SEQIDNO:83-98、102、103、122、123和136-141的多肽具有至少 70 %，优选90 %，的氨基酸序列一致性。18. -种药物制剂，其包含根据前述权利要求所述的结合蛋白或组合物。19. 根据前述权利要求所述的至少一种结合蛋白、组合物或药物制剂用于治疗癌症的 用途。20. -种方法，包括向患者进行根据前述权利要求所述的结合蛋白、组合物或药物制剂 的给药，以治疗癌症。21. 根据权利要求19或20所述的用途或方法，其中在所述用途或方法中，疾病具有选 自下组的至少一种特征： HER2编码基因的扩增， HER2编码基因的过度表达， HER2编码基因的突变形式的表达，和/或 在抗曲妥珠单抗的肿瘤中J1ER3编码基因的过度表达。22. 根据权利要求19-21中所述的用途或方法，其中在所述用途或方法中，疾病为选自 下组的至少一种疾病： 乳腺癌， 卵巢癌， 胃肿瘤， 胃癌， 子宫癌，和/或 结肠直肠癌。
【专利摘要】本发明涉及重组结合蛋白，其至少包含第一和第二重复序列结构域，其中所述2个重复序列结构域中的每一个均结合HER2的胞外区，并且其中所述重复序列结构域通过共价键连接。
【IPC分类】C07K16/32
【公开号】CN104918959
【申请号】CN201380062520
【发明人】乌尔丽克·菲德勒, 伊格纳西奥·多拉多, 海克·施特罗贝尔
【申请人】分子组合公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2013年12月2日
【公告号】CA2892747A1, EP2738180A1, EP2925784A1, US20150299265, WO2014083208A1, WO2014083208A8, WO2014083208A9