zobenzene-4'-carboxylic acid)修饰， 另一端由 EDANS (5-[ (2-aminoethyl) amino]naphthalene-l_sulfonic acid)基团修饰，当 EDANS基团受到激发后，其发射波段可以被Dabcyl基团完全吸收，因此，两个基团位于同一 底物上时，荧光发光被吸收；当底物被水解时，带有EDANS基团的水解底物将会发出非常强 的荧光。
[0117] (二）试验材料
[0118] 底物：H2N-Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Glu (EDANS) -Arg-CO2H(吉尔生物化工公司定制）、Sap2酶（南京钟鼎生物技术有限公司原核表达）。
[0119] (三）其它材料
[0120] 柠檬酸钠缓冲液（50mM，pH 4. 5,含NaCl 50mM，自配）；
[0121] 阳性药：Pepstatin A(Sigma);
[0122] DMSO: Sigma;
[0123] 黑色不结合平底96孔板：Corning，型号3650。
[0124] (四）仪器
[0125] 仪器：Bioteck Synergy 2多功能酶标仪，Gen5操作软件。
[0126] (五）样品配置
[0127] 底物用DMSO配置成18. 75 μ M浓度的待用溶液；阳性药P印A用DMSO溶解，配置 成系列浓度：1〇μΜ~0.0 OlnM;其他待测样品用DMSO溶解，配置成系列浓度：100μΜ~ 0. 01 μ Μ。实验单位：共200 μ L，185 μ L缓冲液+5 μ L酶+5 μ L抑制剂（DMS0溶液）+5 μ L 底物（DMS0溶液），每个浓度单位为双复孔。Sap2酶用pH 4. 5柠檬酸钠缓冲液稀释10倍， 室温活化2h。通过水解18. 75 μ M浓度的底物，将酶稀释到lOOunits/min的浓度，此时荧光 强度随时间成线性增长，酶的稀释液待用。
[0128] (六）试验方法
[0129] a)将185 μ L柠檬酸钠缓冲液、5 μ L Sap2酶、5 μ L抑制剂依次加入黑色96孔板， 设置双复孔，P印A做阳性对照，未加入抑制剂的DMSO做空白。溶液体系充分混合振荡，30°C 孵育30min。
[0130] b)加入18. 75 μ M底物5 μ L，振板混合均勾，以此为时间点，每IOmin测定化合物 焚光发光（λ ex = 340/30nm, λ em = 485/20nm) 〇
[0131] c)根据单位时间荧光发光的增加程度，计算出每个浓度下抑制剂的抑制率％。
[0132] d)把每个浓度的抑制率与样品浓度的log值进行非线性拟合，得到活性与 剂量的依赖关系，通过软件直接得到IC5tl值。软件Graphpad prism 5.0,拟合模块： log(inhibitor) vs response-varible slop，将拟合曲线底部和顶部分别设为0和100%。
[0133] (七）实验结果
[0134] 本发明的部分噻唑酮类化合物对Sap2的抑酶活性见表2。
[0135] 表2.本发明的噻唑酮类化合物对Sap2的抑酶活性
[0136]
[0139] 实施例6 :本发明合成的2, 2' -[(4-{[4-氧-3-(4-甲苯基）-2-(4-甲苯亚氨基） 噻唑烷-5-亚烯基]甲基}-1，3-苯基）二（氧）]二乙酸（表1中化合物29)的线虫体内 抗真菌活性
[0140] (一）试验材料
[0141] 1)菌株
[0142] 白念菌 SC5314(C. albicansSC5314)。
[0143] 2)线虫
[0144] 秀_隐杆线虫 glp-4 ;sek_l (C. elegans glp-4 ;sek_lnematodes)。
[0145] 3)培养基
[0146] BHI培养基，NGM培养基，LB培养基，YPD培养基，M9缓冲液，线虫裂解液。
[0147] 4)药品
[0148] 阳性药氟康唑（fluconazole)，PBS缓冲液作阴性对照。
[0149] (二）试验方法
[0150] 1)线虫的培养
[0151] 含大肠杆菌的NGM培养基15°C培养。大肠杆菌：LB液体培养基37°C培养。
[0152] 2)线虫的同步化
[0153] 线虫于15°C恒温箱中培养5-6d至育卵，用M9缓冲液冲洗干净，加入裂解液线虫， 振荡后收集虫卵；M9缓冲液中孵化24h，得到Ll期幼虫，再转移到NGM培养基上25°C培养 3d，得L4期成虫。
[0154] 3)白念菌线虫感染模型
[0155] a)把生长在YH)琼脂培养基上的白念菌挑取单菌落于2mL YH)液体培养基中， 30 °C培养过夜。次日，取100 y L菌液在BHI琼脂培养基上（含卡那霉素45 μ g/mL)，推出方 形菌斑，30°C培养20h。
[0156] b)同步化的秀丽隐杆线虫glp-4 ;sek_l成虫用M9缓冲液冲洗干净，400~500只 干净线虫置于白念菌方形菌斑内，25°C培养4h (预留作为空白对照的不染菌线虫）。
[0157] c)线虫置于15mL锥形管中用6mL无菌的M9缓冲液仔细冲洗，一共冲洗四次。
[0158] d)在12孔组织培养板（Corning)中，每孔加入2mL培养基（含80 % M9, 20 % BHI， 45 μ g/mL卡那霉素）。之后，每孔放入30只线虫进行培养。
[0159] e)每组药物浓度梯度为4,8，16,32μg/mL，并设立不加药孔对照。每种处理均设 3孔平行对照。将培养板于25°C培养5d，每24h计数各孔线虫存活情况。活线虫形态呈正 弦型；死线虫形态呈直线型，无蠕动，铂丝触碰无反应。
[0160] f)线虫生存数据采用Kaplan-Meier方法进行作图，log-rank检验进行统计学分 析。Ρ〈0· 05认为有统计学意义，作图分析软件Graphpad prism 5.0。
[0161] (三）实验结果
[0162] 根据Sap2抑酶活性结果，对化合物29测试秀丽隐杆线虫（Caenorhabditi s elegans)真菌感染模型体内抗真菌生长活性。氟康挫（fluconazole)作为阳性对照药，使 用剂量为实验常用剂量32 μ g/mL。结果显示，与空白对照比较，化合物29 (P = 0. 0128)对 白念菌感染的线虫均表现出优异的保护作用（图3)，得线虫的生存率维持在70%，与阳性 对照药氟康唑在浓度32 μ g/mL时具有相似的作用效果。
[0163] 实施例7 :本发明合成的2, 2' -[(4-{[4-氧-3-(4-甲苯基）-2-(4-甲苯亚氨基） 噻唑烷-5-亚烯基]甲基}-1，3-苯基）二（氧）]二乙酸（表1中化合物29)的小鼠体内 抗真菌活性
[0164] (一）试验材料
[0165] 1)实验动物
[0166] ICR小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司），清洁级，体重18~20g，雌性。 许可证号码：SCXK(沪）2012-002。实验用动物依据《实验动物之饲养管理与使用的规定》 (http://www. nap. edu/openbook. php ? record_id = 5140&page = Rl)〇
[0167] 2)实验菌株
[0168] 白念菌SC5314(C. albicans SC5314)，本院新药研宄中心提供；氟康唑耐药白念菌 临床株0304103,由长海医院提供，经形态学和生化学鉴定。
[0169] 3)培养基
[0170] YPD(酵母浸膏蛋白胨葡萄糖培养基，yeast peptonedextrose)培养基。
[0171] 4)药品
[0172] 阳性药氟康唑溶于生理盐水；生理盐水作阴性对照；测试药品溶于生理盐水。
[0173] 5)实验仪器
[0174] 全温振荡培养箱（江苏太仓设备厂），高速冷冻离心机（Heraeus)。
[0175] (二）试验方法
[0176] 1)系统性真菌感染模型的建立
[0177] a)将白念菌SC5314或临床株0304103在30°C摇床中，YPD培养基培养，活化后的 菌液以1 %接种到新鲜的YPD培养基中，即ImL YPD中加10 μ L菌液，于IOmL试管中培养 16h〇
[0178] b)将培养好的处于对数生长期的菌液1000 g力量离心5min，0. 9%生理盐水重复 3次洗涤，弃掉上清液，血球计数板计数，用生理盐水将菌液稀释到5 X IO6CFUAiL的注射浓 度。
[0179] c)将ICR小鼠随机分组，每组10只，每个实验组独立重复两次。由尾静脉注射稀 释好的白念菌菌液〇. lmL/10g，使得ICR小鼠产生系统性真菌感染。
[0180] 2)按组给药并观察生存时间
[0181] a) ICR小鼠随机分组（白念菌SC5314感染）：真菌感染模型组（空白对照组）、氟 康挫（0. 5mg/kg)单用治疗组、测试化合物（2mg/kg)单用治疗组。
[0182] ICR小鼠随机分组（氟康唑耐药菌临床株0304103感染）：A组是模型对照组 (Blank)，感染耐药念珠菌后不予治疗；B组为腹腔注射氟康唑0. 5mg/kg ;C组为左腹腔注射 氟康挫0. 5mg/kg，右腹腔注射化合物29剂量2mg/kg (联合用药组）。
[0183] b) ICR小鼠系统性白念菌感染此后，各组小鼠分别腹腔注射给药0. 2mL/只，每天 定时注射一次，连续给药7d。观察小鼠生存情况，记录各组每天死亡个数，计算出每天每组 小鼠的生存率，观察至20d或氟康唑单独给药组全部死亡。
[