膜，封接于塑料膜 内，放在缓动的平台上，室温孵育2h或4°C过夜；
[0180] 3)加 HRP标记抗体（二抗）：将滤膜用TBST洗3次，每次lOmin。用封闭液按1 : 2000稀释二抗，浸润滤膜，放在缓动的转台上，室温孵育Ih ;
[0181] 4)将膜放入TBST溶液中洗涤三遍，每次在摇床上摇动lOmin。
[0182] (4) ECL 显色。
[0183] 3、结果
[0184] 3. I GST-pull down分析ρ38 α诘抗肽突变体对ΤΑΒ1/ρ38 α相互结合的阻断作用
[0185] GST-pull down分析人工化学合成的ρ38 α诘抗肽突变体对ΤΑΒ1/ρ38 α相互结 合的阻断作用，其中PTl作为无功能的对照肽。以对照肽PTl为阴性对照，以ρ38α拮抗肽 ΡΤ5为阳性对照，根据不同的ρ38 α拮抗肽突变体（ΡΤ5-1至ΡΤ5-6)对TABl和ρ38 α结合 能力影响的强弱来确定拮抗肽中的关键氨基酸。
[0186] 与之前课题研宄的结果相同，抑制肽？了5可以在50以1的剂量下对了481/?38€1相 互作用有明显的抑制作用。在相同的条件下，合成的拮抗肽突变体ΡΤ5-2和ΡΤ5-4对TABl/ ρ38 α相互结合的阻断作用有放大作用，ΡΤ5-1，ΡΤ5-3, ΡΤ5-6的阻断效果跟ΡΤ5差别不大， 而ΡΤ5-5氨基酸突变后反而失去对ΤΑΒ1/ρ38α相互结合的阻断作用（图4)，ΡΤ5-5突变体 为将第11、12位的苏氨酸和天冬氨酸用两个丙氨酸来替换，替换后丧失对ΤΑΒ1/ρ38α相互 结合的阻断作用，说明11、12位的苏氨酸和天冬氨酸对ΤΑΒ1/ρ38α相互结合有重要作用， 提示11、12位的苏氨酸和天冬氨酸可能为关键氨基酸。
[0187] 进行三次平行实验，对三次实验结果进行灰度扫描，His-p38a的灰度值与 GST-TABl的灰度值的比值进行半定量比较，更加直观的反应了不同PT5突变体突变之后对 ΤΑΒ1/ρ38α相互结合抑制作用的强弱（图5)，其中表示与对照肽PTl相比P〈0. 01， " "表示与PT5相比Ρ〈0· 05。
[0188] 3. 2 GST-pull down分析ρ38 α拮抗肽突变体对ΜΚΚ6/ρ38 α相互结合的阻断
[0189] 为了分析ΡΤ5突变体是否选择性的抑制ΤΑΒ1/ρ38 α相互结合而不会阻断经典活 化途径，选择ρ38α上游激酶ΜΚΚ6进行GST-pull down和免疫印迹分析。纯化的GST-MKK6 和His_p38 α混合后与不同的PT5突变体混合，观察PT5突变体对两者结合的影响。实验 结果表明，ΡΤ5突变体不会影响经典途径中ΜΚΚ6/ρ38 α相互结合（图6)，提示ΡΤ5突变体 的作用具有靶向ΤΑΒ1/ρ38α的特异性。
[0190] 进行三次平行实验，对三次实验结果进行灰度扫描，His-p38a的灰度值与 GST-MKK6的灰度值的比值进行半定量比较，更加直观的反应了 PT5突变体突变之后对 ΜΚΚ6/ρ38α相互结合抑制作用的强弱（图7)。
[0191] 实施例4 ρ38 α拮抗肽突变体对TABl介导的ρ38 α自我磷酸化的影响
[0192] 1、常用试剂的配制
[0193] 6 X 激酶缓冲液：lmol/L β-glycerolphosphate 120 μ 1，lmol/L MgCl2120 μ 1， lmol/L HEPES 120yl，lmol/L DTT 10yl，lmol/L PNPP 120yl，100mM Na3V042 yl，去离子 水508 μ 1，4°C存放，半年内使用。
[0194] 2、激酶活性分析方法
[0195] (1)每份样品按以下配方配制：1 X激酶缓冲液50 μ 1，lmmol/1 ATP 1~2 μ 1，底 物蛋白2 μ g，体外纯化的激酶2 μ g，PT5及PT5突变体使终浓度为50 μ M ;
[0196] (2)将激酶反应混合液加入上述步骤的微量离心管中，30°C水浴中孵育lh，每 5min轻弹混勾一次；
[0197] (3)每个样品加入上样缓冲液，沸水浴IOmin ;
[0198] (4)进行常规SDS-PAGE和免疫印迹。
[0199] 3、结果
[0200] 3. 1体外激酶活性分析体系的验证与建立
[0201] 为了验证拮抗肽PT5及突变体是否通过阻断ΤΑΒ1/ρ38α结合影响了 Ρ38α的自 我磷酸化，首先要建立有效并且完善的体外激酶活性分析体系。该体系中，非放射性ATP提 供底物磷酸化所需的磷酸基团，His-p38 α为底物，GST-TABl具有激酶的作用，如果该体系 是完善的，那么His-p38a会在GST-TABl作用下发生自我磷酸化，非放射性ATP上的磷酸 基团转移到p38 a第180位苏氨酸和第182位的酪氨酸，使p38 a发生双位点的磷酸化。
[0202] 实验结果显示，在底物His_p38 a都存在的条件下，没有加入磷酸基的供体非 放射性ATP的情况下，His-p38 a不能被磷酸化；加入GST标签蛋白而没有加 GST-TAB1， His_p38 a仅有少量非特异的磷酸化；分别加入1 μ g、2 μ g、4 μ g的GST-TAB1，His_p38 a 可被磷酸化并且磷酸化水平差别不大。以上结果综合表明，该条件下建立的体外激酶活性 分析体系完善可行，该体系ΙμL GST-TABl蛋白即可介导His_p38 a磷酸化，该体系所建立 的实验条件可用于下一步验证拮抗肽PT5及突变体对TABl介导的p38 a磷酸化的影响（图 8) 〇
[0203] 3. 2 p38 a拮抗肽及突变体对TABl介导的p38 a自我磷酸化的影响
[0204] 通过探索建立了有效完善的体外激酶活性分析体系，在相同的条件下，分别加入 对照肽PTl，效应拮抗肽PT5及PT5的六个突变体（PT5-1至PT5-6)。实验结果如图9所示， PT5能够阻断TABl介导的p38 a自我磷酸化，PT5-2和PT5-4发生突变后能够增强对TABl 介导的p38 a自我磷酸化的阻断能力，突变体PT5-UPT5-3和PT5-6氨基酸位点替换后，阻 断TABl介导的p38 a自我磷酸化的能力与野生型PT5差别不大，突变体PT5-5则在突变后 失去影响p38 a自我磷酸化的作用。
[0205] 同样进行三次平行实验，对三次实验结果进行灰度扫描，磷酸化His_p38 a的灰 度值与His_p38 a的灰度值的比值进行半定量比较，更加直观的反应了不同PT5突变体突 变之后对TABl介导的p38 a自我磷酸化的抑制作用的强弱（图10)，其中"**"表示与对 照肽PTl相比P〈0. 01，表示与PT5相比P〈0. 05。
[0206] 3. 3 p38 a拮抗肽及突变体对MKK6介导的p38 a磷酸化的影响
[0207] MKK6/p38a的相互作用能够通过经典的MAPKs超家族成员活化方式导致p38a 第180位的苏氨酸和第182位的酪氨酸发生双位点磷酸化。如果设计合成的拮抗肽及其突 变体不能够阻断MKK6与p38 a之间的相互作用，那么可以推测出拮抗肽及其突变体不会影 响MKK6介导的p38 a级联磷酸化。体外激酶活性分析实验表明，PT5及PT5的各突变体对 p38 a的经典活化途径没有影响，p38 a的磷酸化水平没有区别（图11)。
[0208] 进行三次平行实验，对三次实验结果进行灰度扫描，His_p38 a的灰度值与 GST-TABl的灰度值的比值进行半定量比较，更加直观的反应了 PT5突变体突变之后对MKK6 介导的p38 a级联磷酸化抑制作用的强弱（图12)。
[0209] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种p38 a拮抗肽突变体，其特征在于，所述突变体命名为PT5-4,所述PT5-4的氨 基酸序列为以下组中的任意一个： (1) 如SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列； (2) 在SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个 氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述PT5-4的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。3. 编码权利要求1所述的突变体的DNA分子。4. 一种重组载体，其特征在于，所述载体包括权利要求3所述的DNA分子。5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是病毒载体或非病毒 载体。6. 包含权利要求4或5所述的重组载体的宿主细胞。7. 权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的DNA分子、权利要求4或5所述 的重组载体、或权利要求6所述的宿主细胞在制备抑制TABl/p38 a相互作用的药物中的应 用。8. 权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的DNA分子、权利要求4或5所述的 重组载体、或权利要求6所述的宿主细胞在制备治疗TABl/p38 a相互作用导致的疾病的药 物中的应用。9. 权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的DNA分子、权利要求4或5所述 的重组载体、或权利要求6所述的宿主细胞在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应 用。10. -种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1或2所述的突变体、 权利要求3所述的DNA分子、权利要求4或5所述的重组载体、或权利要求6所述的宿主细 胞。
【专利摘要】本发明公开了一种可用于治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽药物，该多肽是p38α拮抗肽PT5的一种突变体。本发明的p38α拮抗肽PT5突变体PT5-4可以抑制TAB1与p38α的相互作用，从而抑制由于TAB1与p38α相互作用导致的细胞凋亡，因此本发明的p38α拮抗肽PT5突变体可作为治疗心肌缺血再灌注损伤的候选药物，具有广泛的临床应用价值。
【IPC分类】C07K7/08, A61K48/00, A61P9/10, A61K38/10, C12N15/11
【公开号】CN104961803
【申请号】CN201510397851
【发明人】张纪岩, 王庆阳, 裴钰君, 冯健男, 沈倍奋
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月8日