黑暗发酵培养lOd。
[004引固态发酵培养基配方：麦杆（粉碎至l-3mm，且脱木素）1.5g，款皮1.5g， 10XMandels培养基（同上述，不含駿甲基纤维素钢）5血，W上组分装入250-mLS角瓶中， 充分混匀，高压灭菌。麦杆的脱木素方法：按每lOg麦杆加入20mL4%化0H溶液，混匀后， 121°C20min处理，并W流水去除褐色物质，处理后的麦杆惊干。
[0044] 发酵结束后，按每S角瓶加入30血无菌水（含0. 1%Tween-80)，揽拌均匀，并于 28°C、120巧m振荡浸提2h。继续W7000巧m离屯、20min，将粗酶液转入新的离屯、管中，于4°C 冰箱保存。
[0045] 滤纸酶活的测定，^WhatmanNO. 1滤纸（3cmX0. 5cm)作为底物，70°C反应60min; CMC酶（内切型纤维素酶EG)酶活的测定W1%的駿甲基纤维素钢（CMC-Na)作为底物，70°C 反应30min;最后均WDNS的方法测定还原糖的生成量，通过标准葡萄糖曲线，换算获得酶 活（lu/g基质干重）。木聚糖酶活性W〇. 1%样木木聚糖炬eechwood，sigma)作为底物， 70°C反应lOmin，W3, 5-二硝基水杨酸法值NS)的方法测定还原糖的生成量，通过标准木 糖曲线，换算获得酶活（lU/g基质干重）。0 -葡萄糖巧酶的活性测定，W5mM的4-硝基苯 基-0-D-化喃葡萄糖巧（pNPG)作为底物，70°C反应30min，并根据标准曲线，计算酶活性 (lU/g基质干重）。W上酶活测定均在抑4. 8的50mM的巧樣酸缓冲液中进行，每处理3-4 次重复。
[0046] 滤纸酶、CM"EG)酶或木聚糖酶单位酶活定义为；该实验条件下，每分钟催化相应 底物生成1ymol葡萄糖（滤纸酶和CMC)或木糖（木聚糖酶）的酶量。0-葡萄糖巧酶单 位酶活定义为；该实验条件下，每分钟催化pNPG生成1ymol4-硝基苯酪的酶量。
[0047] 发酵结果见图3,在最佳发酵条件下，CMC酶活最高可达554IU/g，木聚糖酶活为 385IU/g，0 -葡萄糖巧酶活为218IU/g，而滤纸酶活为2. 62IU/g。
[0048] 实施例3微细正青霉所产纤维素酶和木聚糖酶的温度适应性
[00例最适反应温度的测定，WPH4. 8的50mM的巧樣钢作为缓冲液，分别测定30-95°C(间隔5°C)下的粗酶的CMC酶巧G)、木聚糖酶和0-葡萄糖巧酶活性（方法同上 述）。
[0化0] 为评价各酶组分的温度稳定性，取原酶液100y1于不同温度（40-60°C或 50-70°C)下分别保温1-化。处理结束后，分别测定各种酶活性，并W未处理组（4°C存放） 的酶活作为100%，比较处理后的残余酶活性。
[0化1] 如图4-A所示，微细正青霉4-14所产CMC酶的最适反应温度为70°C，8(rC仍有 70%W上的活性；0 -葡萄糖巧酶的最适反应温度为7〇°C，75°C活性仍达95%;木聚糖酶的 最适反应温度为75°C，在85°C时仍然有70%的活性。温度稳定性为；CMC酶在50°C和60°C 下分别处理化残余酶活达85%和80%;木聚糖酶60°C处理化，残余酶活接近70%; 0 -葡 萄糖巧酶在40°C时热稳定性较好，处理化，残余酶活高于80% (图4-B-D)。
[0化2] 实施例4、微细正青霉所产纤维素酶和木聚糖酶的抑适应性
[0化引最适反应抑的测定，依据文献配置广泛缓冲液（TurnerB.L. ,VariationinpH optimaofhydrolyticenzymeactivitiesintropicalrainforestsoils.Applied andEnvironmentalMicrobiology，2010,76(19)，6485-6493)，比较测定地2-10(间隔 0.5)的粗酶CMC酶巧巧、木聚糖酶和0-葡萄糖昔酶活性。
[0054] 为评价各酶组分的抑稳定性，取原酶液100y1于抑2-10 (间隔1)下于4°C放置 16h。处理结束后，WpH4. 8的50mM的巧樣钢作为缓冲液，70°C下测定各种酶活性，并W未 处理组的酶活作为100%，比较处理后的残余酶活性。
[005引广泛抑缓冲液配方；6. 3g棚酸，14. Og巧樣酸，11. 6g顺了締二酸，12. Ig Tris base, 19. 5g化OH溶解于适量蒸馈水并定容至500血。取上述溶液50血，W IM肥1或IM 化OH调节至相应抑，并W蒸馈水定容至100血。
[0化6]结果；微细正青霉4-14所产CMC酶和0 -葡萄糖巧酶的最适抑为4. 5,木聚糖酶 的最适抑为5. 0(图5-A)。在抑3-10的缓冲液中4°C处理16h，CMC酶和木聚糖酶能保持 80-100%的活性；0-葡萄糖巧酶在pH3-8时活性不降低（图5-B)。
[0057] 实施例5、微细正青霉发酵胞外蛋白图谱及酶解图谱
[005引取微细正青霉4-14粗酶液30 y 1，W 10%聚丙稀酷胺进行常规SDS-PAGE分析。为 分析粗酶液SDS-PAGE中CMC酶和木聚糖酶条带位置，进行了SDS-PAGE酶活性染色实验操 作如下：样品加入上样缓冲液后，95°C失活lOmin，W含有0. 1% CMC-Na或0. 1% Beechwood 木聚糖的聚丙稀酷胺凝胶进行电泳。电泳结束后，凝胶化含20% (v/v)异丙醇的PBS缓冲 液（P册.8)漂洗20min，继续W PBS缓冲液（P册.8) 20minX 3次。将凝胶置于PBS缓冲液 (P册.8)中50°C保温比（对CMC-化）和5min(对木聚糖）。将处理好凝胶置于0. 1%的刚 果红溶液中染色30min，最后W1M化C1脱色，并观察脱色条带的位置，拍照比较。结果：微 细正青霉4-14的发酵粗酶液SDS-PAGE分析，其主要胞外蛋白分布于35-130kDa分子量范 围（图6-A)。其中，CMC酶的条带处于50-55kDa之间，而木聚糖酶的条带处于60-70kDa之 间（图6-A)。
[0化9] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出；对于本技术领域的技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，该些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种土壤真菌微细正青霉，其特征在于，其分类命名为微细正青霉4-14 4-14)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年6月 25 日，保藏号为 CCTCC No: M2015404。2. 根据权利要求1所述的土壤真菌微细正青霉，其特征在于，所述土壤真菌微细正青 霉菌株的生长温度为28°C ~45°C。3. 根据权利要求2所述的土壤真菌微细正青霉，其特征在于，所述土壤真菌微细正青 霉菌株的最适生长温度为37°C。4. 权利要求1所述的土壤真菌微细正青霉在生产高温纤维素酶和木聚糖酶方面的应 用。5. 权利要求4所述应用，其特征在于，所述土壤真菌微细正青霉菌株能够以小麦杆和 麸皮为基料发酵产生高温纤维素酶和木聚糖酶。6. -种发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取少量微细正青霉4-14真菌菌块接种于50 mL PDA培养液，37 °C、200 rpm下振荡 培养7 d得到菌悬液； 2) 取I mL菌悬液接入固态发酵培养基中，并于37 °C、70%湿度条件下黑暗发酵培养9 d ; 3) 发酵结束后，按每发酵瓶加入30 mL无菌水，搅拌均匀，并于28 °C、120 rpm振荡浸 提2 h，继续以7000 rpm离心20 min得到粗酶液，将粗酶液转入新的离心管中，加入终浓 度0. 1%叠氮钠，于4 °C冰箱保存。7. 根据权利要求6所述的发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，其特征在于， 所述固态发酵培养基包括脱木素后的麦杆1.5 g，麸皮1.5 g，不含羧甲基纤维素钠的10 XMandels 培养基 5 mL。8. 根据权利要求7所述的发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，所 述麦杆的脱木素方法：按每10 g麦杆加入20 mL 4% NaOH溶液，混匀后，121 °C 20 min处 理，并以流水去除褐色物质，处理后的麦杆晾干即可。9. 根据权利要求6所述的发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，所 述发酵得到的粗酶液的SDS-PAGE分析图谱中，主要胞外蛋白分布于35-130 kDa分子量范 围，其中，CMC酶的条带处于50-55 kDa之间，而木聚糖酶条带处于60-70 kDa之间。10. 根据权利要求6所述的发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，所 述CMC酶最适反应温度为70°C，80°C仍有70%以上的活性；0 -葡萄糖苷酶的最适反应温度 为70°C，75°C活性仍达95% ;木聚糖酶的最适反应温度为75°C，在85°C时仍然有70%的活 性，温度稳定性为：CMC酶在50°C和60°C下分别处理4 h残余酶活达85%和80% ;木聚糖酶 60°C处理4 h，残余酶活接近70% ; 0 -葡萄糖苷酶在40 °C时热稳定性好，处理4 h，残余酶 活尚于80%。
【专利摘要】本发明公开一种土壤真菌微细正青霉，其分类命名为微细正青霉4-14（Eupenicillium parvum 4-14），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年6月25日，保藏号为CCTCC No: M2015404。本发明公开土壤真菌微细正青霉在生产高温纤维素酶和木聚糖酶方面的应用。本发明公开一种发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法。本发明菌株能以小麦杆和小麦麸皮为主要原料，发酵合成高活性的纤维素酶和木聚糖酶。同时，发酵产纤维素酶和木聚糖酶具有高温（70-75℃）和低pH（4.5-5）的催化特性，具有优良的温度和pH稳定性。本发明对耐高温纤维素酶和木聚糖酶资源的工业利用具有重要价值。CCTCC NO：M 201540420150625
【IPC分类】C12R1/645, C12N9/42, C12N1/14
【公开号】CN104988077
【申请号】CN201510457029
【发明人】龙良鲲, 丁少军, 丁达繁, 寒子纯
【申请人】南京林业大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月29日