学重复各3次。
[0137] 1、存活率
[0138] 无氮处理21天后，每株系取3棵转SiLNT2水稻，以嫩叶仍有绿叶为存活标准，统 计存活率。
[0139]结果如图2所示：无氮处理后，野生型水稻（Ki)、T3代转SiLNT2水稻Ll株系（LI)、 T3代转SiLNT2水稻L2株系（L2)和1~3代转SiLNT2水稻L3株系（L3)的存活率分别为65%、 90 %、93 %、94 %。说明在无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的存活率明显 提尚。
[0140] 2、鲜重
[0141] 无氮处理21天后，取样称鲜重，每株系取5棵转SiLNT2水稻。
[0142] 结果如图3所示：无氮处理后，和野生型水稻（Ki)相比，T3代转SiLNT2水稻Ll株 系（LI)、T3代转SiLNT2水稻L2株系（L2)和T3代转SiLNT2水稻L3株系（L3)的鲜重明显 高于野生型水稻。说明经过无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的鲜重明显 提尚。
[0143] 3、株高
[0144] 无氮处理21天后，取样测量株高，每株系取5棵转SiLNT2水稻。
[0145] 结果如图4所示：无氮处理后，和野生型水稻（Ki)相比，T3代转SiLNT2水稻Ll株 系（LI)、T3代转SiLNT2水稻L2株系（L2)和T3代转SiLNT2水稻L3株系（L3)的株高明显 高于野生型水稻。说明经过无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的株高明显 提尚。
[0146] 4、蛋白质含量
[0147] 无氮处理21天后，采用Bradford法测定蛋白质含量。具体步骤如下：先配制Img/ ml的牛血清蛋白（BSA)母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS)配制一组浓度分别为 I. 0mg/ml、0. 8mg/ml、0. 6mg/ml、0. 4mg/ml、0. 2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释 10 倍， 得到一组浓度分别为 0? 10mg/ml、0. 08mg/ml、0. 06mg/ml、0. 04mg/ml、0. 02mg/ml的BSA溶 液。计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。作出吸光度对BSA浓度的关 系曲线。
[0148] 每组称Ig样品，加IOmL的PBS研磨，离心，取上清测量。根据标准曲线计算蛋白 质含量。
[0149] 结果如图5所示：无氮处理后，和野生型水稻（Ki)相比，T3代转SiLNT2水稻Ll株 系（LI)、T3代转SiLNT2水稻L2株系（L2)和T3代转SiLNT2水稻L3株系（L3)的蛋白质含 量明显低于野生型水稻。说明经过无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的蛋 白质含量降低，将体内的蛋白质转换成氨基酸的能力比野生型水稻强，可以供给植株在低 氮饥饿处理时的能量。
[0150] 5、总氮量
[0151] 无氮处理21天后，取样测量。采用快速消煮法测量总氮量，具体步骤如下：每组称 取植物样品0. 25g(称准至0. 0002g)，放入消煮管，加Iml水湿润，加入4ml浓H2SO4摇匀， 过夜。分两次各加入2mlH2O2，每次加入后均摇匀，待激烈反应结束后，进行消煮。固体成 为溶液，浓硫酸冒白烟，溶液呈褐色时，停止加热，此过程大约十分钟。冷却到不烫手时，加 入2mlH2O2,继续消煮5-10分钟，冷却，再加入2mlH2O2消煮，反复进行直到溶液无色或清 亮后（大约8-10ml双氧水）再继续加热5-10分钟，以除去剩余的双氧水。冷却，用蒸馏水 将消煮液定容到100mL容量瓶。待测。
[0152] 结果如图6所示：无氮处理后，和野生型水稻（Ki)相比，T3代转SiLNT2水稻Ll株 系（LI)、T3代转SiLNT2水稻L2株系（L2)和T3代转SiLNT2水稻L3株系（L3)的总氮含量 明显高于野生型水稻。说明经过无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的总氮 含量明显提尚。
[0153] 6、表型
[0154] 无氮处理21天后，观察野生型水稻、T3代转SiLNT2水稻Ll株系、T3代转SiLNT2 水稻L2株系和T3代转SiLNT2水稻L3株系的表型。
[0155] 结果如图7所示：无氮处理后，野生型水稻的生长明显受到抑制；和野生型水稻 (Ki)相比，T3代转SiLNT2水稻Ll株系（LI)、T3代转SiLNT2水稻L2株系（L2)和T3代转 SiLNT2水稻L3株系（L3)受抑制的程度明显低于野生型水稻。说明经过无氮源处理后，和 野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的低氮耐性明显提高。
【主权项】
1. 蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质： a) 氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白质； b) 在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质； c) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。2. 与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述Al)至A20)中的任一种： Al)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子； A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒； A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体； A4)含有A2)所述表达盒的重组载体； A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物； A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物； A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物； A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系； A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系； All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系； A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系； A13)含有Al)所述核酸分子的转基因植物组织； A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织； A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织； A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织； A17)含有Al)所述核酸分子的转基因植物器官； A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官； A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官； A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。3. 根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或 2)或3)所示的基因： 1) 其编码序列是序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子； 2) 与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋 白质的cDNA分子或基因组DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质 的cDNA分子或基因组DNA分子。4. 权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物抗逆性 中的应用； 或权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育抗逆性转基 因植物中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为低氮耐性。6. -种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码 基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植 物。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是 序列表中序列1所示的DNA分子。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为低氮耐性。9. 根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或 双子叶植物。10. 扩增编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子全长或其片段的引物对。
【专利摘要】本发明公开了一种与植物低氮耐性相关的SiLNT2蛋白及其相关生物材料与应用。该蛋白是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。本发明通过实验证明，本发明提供的蛋白具有提高植物低氮耐性的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。
【IPC分类】C12N15/62, C12N15/82, C12N15/29, C07K19/00, A01H5/00, C07K14/415
【公开号】CN105001314
【申请号】CN201510422522
【发明人】马有志, 陈明, 徐兆师, 李连城, 周永斌, 李薇薇, 王二辉
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月17日