一种芹菜素在线二维复合液相提取纯化方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种蔬菜中的成分的提取分离方法，特别涉及一种芹菜素在线二维复 合液相提取纯化方法。
【背景技术】：
[0002] 伴随着畜牧兽医业的前进与发展，从某些方面来说，我们发现了更多的疾病，更多 的细菌与病毒，已有的细菌与病毒更是发生了很多变异。畜禽大规模的集约化养殖加大了 动物患病的可能，增加了传染病的发生，同时降低了动物对于一般病原体的抵抗力。为了对 抗病原体的侵袭，治疗疾病，保证生产，减少利益损失，人们必须加大药物的使用量和种类， 如抗生素类药物。然而大量的使用抗生素类药物也会带来许多严峻问题，这些问题在当今 的生产生活中日益显著。首先，是滥用抗生素药物引起畜禽体内正常菌群紊乱，造成免疫力 低下，增加了二次感染和继发感染发生的可能性，使治疗效果越来越差，形成恶性循环。其 次，集约化养殖中大量的应用抗生素类的药物也会造成药物残留的超标，会严重影响动物 性产品的进出口贸易，危害到人类的身体健康。
[0003] 因此，在畜牧兽医产业中，我们应当采取相应的应对措施：一方面严格管理控制抗 生素的使用，另一方面，我们应寻找能代替抗生素的新型理想药品。近年来，现代中兽医学 飞速发展，现代的中兽医药有着优质，高效，稳定，安全，质量可靠，用药方便等几大特点。 因为，中药多来自于天然植物，所以它具有着很多的天然属性，例如，化学成分组合的合理 性，药物的功效的整体性以及双向性，并且毒副作用小，不容易导致病原微生物，病毒等产 生耐药性，极少情况下在动物体内形成有害药物残留的优点。作为一种中药制剂，芹菜素， 有着无毒，温和，无残留等优势。如何将芹菜素类产品大规模生产和推广应用，需要我们对 其进行深入研究，开发和创新。这样，才能使芹菜素类产品在畜牧生产中发挥无限潜能。
[0004] 芹菜素的研究概况：
[0005] 中医认为芹菜，具有有平肝清热，祛风利湿，除烦消肿，凉血止血，解毒宣肺，健胃 利血、清肠利便、润肺止咳、降低血压、健脑镇静的功效。
[0006] 近5年来，有很多有关于芹菜素的药理作用方面的一些研究，经过归纳与总结，主 要对以下几个方面有药理作用。对中枢神经系统有镇静作用和对皮质神经元的保护作用； 有抗菌作用；对心血管有降压作用和对动脉粥样硬化的预防作用；对肿瘤有抑制肿瘤细胞 生长、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成、侵袭和转移和抗氧化作用；雌激素样作用； 还有化疗增敏作用、放疗增敏作用、诱导分化、抗突变作用等。
[0007] 本发明建立了一套芹菜素的提取与纯化方法和流程，为拓展芹菜素的应用范围及 其药理作用的研究提供了实验基础，为进一步开发与利用芹菜资源打下了坚实的基础，芹 菜素的抗菌作用十分显著，使得芹菜素在中国畜牧业上有着极大的发展潜力。
【发明内容】
：
[0008] 为了获得单一的芹菜素成分，去除芹菜中的其他成分及杂质，本发明采用二维液 相色谱法对芹菜素粗体品进行分离纯化。将分离纯化后的芹菜素样品通过高效液相色谱检 测，证明本发明方法可以得到高纯度的芹菜素，在纯度，收率和成本上由于现有技术。
[0009] 为此，本发明提供一种从芹菜中提取分离芹菜素的方法，所述方法步骤如下：
[0010] 步骤1，取干燥的芹菜叶，用乙醇提取，提取液过滤，浓缩至干；
[0011] 步骤2,取步骤1的提取物与C4填料混合，加入甲醇，置40°C旋转蒸发仪中旋转蒸 发除去甲醇，得到干燥粉末；
[0012] 步骤3,取步骤2得到的干燥粉末，装填制备色谱柱，连入在线二维液相色谱分离 系统。
[0013] 其中的色谱分离条件如下：
[0014] 表1?主分离色谱条件
[0015]
[0019] 样品在在线二维液相色谱分离系统中的流程如下：
[0020] 样品通过定量环，在分离柱I中运用低压梯度得到分离。在分离柱中洗脱液通过 捕获柱时，由于捕获柱中水的加入使其极性增加，主分离柱中的馏分被富集在18根捕获柱 中。被捕获的馏分通过分离柱II使达到二次分离，整个分离过程结束。
[0021] 芹菜提取物经在线二维色谱分离后，收集的19号馏分经高效液相色谱色谱柱检 测结果制备的芹菜素含量达95%以上。
[0022] 本发明优选的方法如下：
[0023] 步骤如下：
[0024] 步骤1，称取香芹叶粉末8-128，加入到400-6001111锥形瓶中，加入90-98%乙醇溶 液80-120ml，将锥形瓶放入超声波清洗机中，设定超声功率240-260W，温度60-70°C提取 0. 5-lh;用孔径0. 4-0. 5ym微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤渣加入90-98%乙醇溶 液60-80ml，超声提取0. 5-lh，用孔径0. 4-0. 5ym微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤 渣加入90-98%乙醇溶液60-80ml，超声提取0. 5-lh，用孔径0. 4-0. 5ym微孔滤膜过滤，将 提取液和滤渣分离，将3次提取液合并，旋转蒸发浓缩至干，得到香芹粗提样品；
[0025] 步骤2.粗提芹菜素在线二维液相色谱的分离
[0026] 称取0. 3-0. 5g香序粗提样品，与1-1. 5gC4混合至旋转蒸发瓶中，
[0027] 加入10_20mL甲醇，超声使其溶解完全，置40-50°C旋转蒸发仪中旋转蒸发除去甲 醇，得到干燥的均匀粉末状混合物，将样品装柱，然后将该柱连入在线二维液相色谱分离系 统管路，分离条件如下：
[0028] 表1?主分离色谱条件
[0029]
[0030] 表2?二步分离色谱条件
[0031]
[0032] 样品通过进样柱，在分离柱I中运用低压梯度分离，分离柱中的馏分被富集在18 根捕获柱中，被捕获的馏分通过分离柱II达到二次分离，单一化合物的洗脱液由馏份收集 器上的微孔板收集，收集的19号馏分为芹菜素。
[0033] 名词术语的解释：
[0034] 序菜素：分子式：C15H1()05;分子量：270. 25;属于黄酮类化合物：化学结构为4, 5, 7 一三羟黄酮，其4, 5, 7位置的3个羟基和C2C3双键决定了其独特的药理学特性。芹菜素是 一种黄色的结晶体，熔点为347~348°C、难溶于水，但是易溶于甲醇、乙酸乙酯、乙醚等有 机溶剂，因其分子中含有酚羟基，故显酸性，可以溶于碱性水溶液中。
[0035] 在线二维液相色谱分离系统：模式图见图20,该系统为现有技术，可以从市场上 购买得到，如德国色谱公司生产的250型号的二维分离系统。
[0036]C4:为一种分离色谱柱所用的填料
[0037] 本发明的筛选过程如下：
[0038] 实验方法
[0039] 1.芹菜素标准溶液的制备
[0040] 称取芹菜素标准品5mg，用甲醇定容于10ml容量瓶中，摇匀备用。
[0041] 2.香序粗提样品溶液的制备
[0042] 2. 1新鲜香芹洗净后，将根茎叶分开，剪碎，在干燥烘干箱中65°C完全干燥，分装。
[0043] 2. 2准确称取香芹叶粉末10. 0g，加入到500ml锥形瓶中，加入95 %乙醇溶液 100ml，将锥形瓶放入超声波清洗机中，设定超声功率250W，温度65°C提取0. 5h。
[0044] 2. 3用孔径0. 45ym微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤渣加入95 %乙醇溶液 70ml,超声提取0. 5h。
[0045] 2. 4重复步骤2. 32次。
[0046] 2. 5将3次提取液合并，旋转蒸发浓缩至干，用一定体积甲醇溶解，备用。
[0047] 3.紫外最适吸收波长的选取
[0048] 使用NanoDrop2000核酸蛋白检测仪的UV-VIS程序，检测粗提芹菜素最适吸收波 长，选取经过滤的30%乙醇作为基点调零。
[0049] 使用核酸蛋白检测仪的UV-VIS程序从200-800nm范围内自动扫描0. 0、0. 3、0. 6、 0. 9、1. 2、1. 5、1. 8ml标液，确定芹菜素最适吸收波长。
[0050] 4.粗提芹菜素在线二维液相色谱的分离
[0051] 4. 1上样样品的准备
[0052] 称取0.4g香芹粗提样品与1. 2gC4混合至旋转蒸发瓶中，加入约15mL甲醇，超声 使其溶解完全，置40°C旋转蒸发仪中旋转蒸发除去甲醇，得到干燥的均匀粉末状混合物。依 照进样柱装填方法将样品装柱，然后将该柱连入在线二维液相色谱分离系统管路。
[0053] 4. 2样品在二维液相色谱柱中的流程
[0054] 样品（固体）通过进样柱，在分离柱I中运用低压梯度得到分离。在分离柱中洗 脱液通过捕获柱时，由于捕获柱中水的加入使其极性增加，主分离柱中的馏分被富集在18 根捕获柱中。被捕获的馏分通过分离柱II使达到二次分离，整个分离过程结束。单一化合 物的洗脱液由馏份收集器上的微孔板得到收集，可以进一步地得到分析。
[0055] 通过选取不同的流动相体系，改变主分离流动相条件等因素，可以得到不同的主 分离色谱图，通过寻找最佳条件，将主分离图上各峰分开，进而建立芹菜素样品的最佳二维 液相分离方法。
[0056] 4. 3馏分收集
[0057]自动收集各馏分，将各个馏分别置于离心管中，标记好后放置于冰箱4°C保存。
[0058] 5?高效液相色谱检测
[0059] 5.1样品的准备
[0060] 5. 2. 1取10mg芹菜素标准品溶于少量甲醇中，置于25mL容量瓶中，甲醇定容摇匀， 0. 22um有机H旲过滤后备用；
[0061] 5. 2. 2分别取4. 3收集的各个样品分离馏分经0. 22um有机膜过滤备用，
[0062] 5. 2检测用色谱条件
[0063] 色谱柱：C18;柱温：室温；流动相：甲醇0. 4%，磷酸水溶液（1 :1);流速：0. 8ml/ min;检测波长：346nm.将5. 1制备的样品用高效液相色谱仪检测。
[0064] 6?芹菜素含量的测定
[0065] 芹菜素含量的测定采用高效液相色谱法。准确称取52. 6mg的芹菜素对照品溶解 于适量甲醇中，并准确定容于1001^作为母液，然后分别取0.25、0.5、1、2、3、511^于6个 10mL的容量瓶中，并用甲醇定容，作为不同浓度的标准液，取上述标准液过0. 45ym的滤膜 后，用色谱进行测定，色谱柱为C18柱（4. 6x250mm，5ym)，流动相为甲醇0. 4%，磷酸水溶 液（1:1)，流速〇. 8mL/min，检测波长为346nm，进样量为10yL。以色谱峰面积为纵坐标，芹 菜素对照品浓度为横坐标，得线性回归方程Y= 33783X-43787,R2 = 0. 9991，可知芹菜素 在0. 013-0. 26mg/mL范围内峰面积与浓度呈良好的线性。
[0066]关系。
[0067] 7结果与分析
[0068] 7. 1紫外最适吸收波长的选取
[0069]由图1可知，从800-200nm范围内自动扫描，芹菜素标准品在200-800nm全波长 扫描的图谱中显示，芹菜素在200nm、270nm和346nm条件下有吸收峰的存在。而且2个波 长下的峰形都较规则，都有利于检测波长的选择，但在346nm条件下，有较高的吸收值，干 扰少，峰型更加规则和稳定，有利于芹菜素液相条件下的检测。故选择346nm作为紫外检测 用波长。
[0070] 图1紫外全波长扫描图
[0071] 7. 2二维液