百日咳杆菌fha抗原单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品及制备领域，具体涉及百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体及其 应用。
【背景技术】
[0002] 百日咳是由百日咳杆菌（BordetellaPertussis)引起的严重急性呼吸道传染病， 主要感染5岁以下儿童，对于未免疫或未完成基础免疫程序的儿童，百日咳仍是导致其死 亡的主要原因。百日咳是可以通过疫苗预防的传染病，全球自20世纪50-60年代广泛使用 全细胞百日咳疫苗（WP)以来，尤其是1974年全球实施扩大免疫规划（EPI)后，百日咳的 流行得到有效控制，发病率和死亡率明显下降。但是，接种全细胞百日咳疫苗（WP)可能产 生一定的不良反应，比如严重的神经系统并发症等，严重的甚至导致死亡。1981年日本首 先研制成功无细胞百日咳疫苗（AP)，含有百日咳毒素和丝状血凝素，替代了百日咳全菌体； 其不良反应明显低于WP，目前AP与白喉和破伤风疫苗组成的联合疫苗DTaP已成为许多国 家儿童联合免疫的基础。现已通过美国食品药品管理局（FDA)批准的三联DTaP联合疫苗 主要有：赛诺菲巴斯德公司（SanofiPasteus，SP)的Tripedia?和Daptacel?，葛兰素史克 公司（GlaxoSmithKline，GSK)的Infanrix?。
[0003] 百日咳杆菌的抗原组份主要包含百日咳毒素（PertussisToxin，PT)、丝状血清 素（FilamentousHemagglutinin，FHA)、凝集原（Agglutinogen，Agg) 2, 3 和百日咳黏着素 (Pertactin，PRN)，在无细胞百日咳疫苗中主要包含上述组分，其中PT和FHA属于主要组 份。
[0004]目前《中华人民共和国药典》2010年版三部中对于含有无细胞百日咳成分的联合 疫苗中有效抗原（FHA等）的鉴别实验，主要是通过酶联免疫吸附实验（ELISA)，而具有高度 特异性的FHA单克隆抗体可以大大提高实验的准确性和可靠性；同时药典中对于百日咳抗 原含量的测定主要包括蛋白氮含量测定、SDS-PAGE纯度测定以及效价测定。其中，蛋白氮含 量测定以及SDS-PAGE法测定不是特异性检测方法，无法特异性区分PT、FHA、PRN，在三种组 分混合的百日咳疫苗以及DTaP疫苗中，上述方法无法用于FHA成分的检测，而效价实验步 骤复杂、过程较长且需要大量实验动物，不利于疫苗生产过程中对于各个步骤FHA含量的 监测，也违背WHO关于减少动物使用量的原则。因此使用高度特异性的FHA单克隆抗体采用 ELISA法对于百日咳FHA纯化各个步骤样品以及百日咳类疫苗成品中FHA抗原含量进行检 测，将大大提高检测的准确性、特异性和工作效率，降低试验的时间成本和资金成本。目前 存在的FHA单抗都是将纯化后抗原免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，该方法制备的单抗经过多 步纯化过程，蛋白变性后复性等步骤可能导致蛋白空间构象变化，免疫原性遭到部分破坏， 致使以其为免疫原制备得到的单抗仅能够识别该空间构象已发生变化的抗原，而无法识别 全真抗原（原始抗原）。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是突破目前DTaP疫苗生产过程各个步骤以及成品中对于FHA抗原 含量检测方法特异性差、检测效率低的缺点，提供一种效价高、均一度高、具有良好特异性、 稳定性的低成本的百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体，实现降低成本、提高百日咳疫苗生产 过程中质控的准确性和效率的目标。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提供一种百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体杂交瘤细胞 株，其保藏编号为CGMCCNo. 10589。
[0007] 所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)，地址北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo. 10589， 保藏日期2015年5月4日，分类命名为：百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0008] 本发明提供了所述杂交瘤细胞株在制备检测百日咳杆菌FHA抗原试剂盒中的应 用或在制备检测百日咳杆菌FHA抗体试剂盒中的应用。
[0009] 本发明还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
[0010] 具体而言，本发明采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备抗百日咳杆菌FHA抗原单 克隆抗体，步骤如下：
[0011] (1)制备百日咳杆菌发酵液。
[0012] (2)动物免疫：收集菌体，研磨，然后将研磨后的百日咳杆菌菌体与弗氏佐剂等比 例混合并乳化；乳化后〇. 2iig/只腹腔免疫小鼠。
[0013] (3)加强免疫；首次免疫后2周，对小鼠进行2次加强免疫，剂量和佐剂用量同上。 免疫后采用间接酶联免疫法检测抗体效价，如果抗体效价大于1〇 3,则进行研磨抗原的腹腔 冲击，0. 2yg/只，否则继续加强免疫。
[0014] (4)取腹腔冲击3天后的免疫后小鼠的脾脏，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按 1:10~10:1的比例混合，于37°C水浴滴加50%PEG4000进行细胞融合；然后缓慢加入无 血清培养基2ml洗涤2次融合后的细胞，再加入完全培养基2ml重悬，将细胞悬液100y1/ 孔加入到细胞培养板培养，培养后添加HAT培养液2ml。
[0015] (5)杂交瘤细胞长到瓶底的50%以上时，ELISA法检测细胞上清中的抗体效价。筛 选出特异性针对百日咳杆菌FHA抗原的、高效价的杂交瘤细胞株，扩大培养建库，冻存，并 将该杂交瘤细胞株进行生物保藏。
[0016] (6)将冻存的工作种子库细胞复苏，培养到细胞覆盖瓶底的50%以上时摇下细 胞，计数，腹腔免疫小鼠，制备腹水。
[0017] 本发明还提供包含上述单克隆抗体的试剂盒。
[0018] 所述试剂盒中，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。
[0019] 进一步地，所述单克隆抗体经酶标记。
[0020] 进一步地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。
[0021] 所述试剂盒中，所述单克隆抗体可以不经过生物标记或化学标记，而是通过添加 生物标记或化学标记的抗鼠二抗进行试验。
[0022] 进一步地，所述抗鼠二抗经酶标记。
[0023] 进一步地，所述抗鼠二抗经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。
[0024] 所述试剂盒中，单克隆抗体可以用于包被。
[0025] 进一步地，所述试剂盒添加生物标记或化学标记的夹心抗体。
[0026] 进一步地，所述试剂盒也可以添加夹心抗体后，再加入生物标记或化学标记的抗 夹心抗体的二抗。
[0027] 所述的试剂盒用于百日咳杆菌FHA抗原的检测。
[0028] 本发明提供了杂交瘤细胞株CGMCCNo. 10589分泌的单克隆抗体在制备检测百日 咳杆菌抗原试剂盒中的应用。
[0029] 进一步地，所述百日咳杆菌抗原为百日咳杆菌PHA抗原。
[0030] 本发明提供了杂交瘤细胞株CGMCCNo. 10589分泌的单克隆抗体在制备检测百日 咳杆菌抗体试剂盒中的应用。
[0031] 进一步地，所述百日咳杆菌抗体为百日咳杆菌PHA抗体。
[0032] 本发明提供了杂交瘤细胞株CGMCCNo. 10589分泌的单克隆抗体在制备预防或治 疗百日咳杆菌感染药物中的应用。
[0033] -种治疗或预防百日咳杆菌感染引起的疾病的药物，其含有本发明所述的单克隆 抗体。
[0034] 保藏编号为CGMCCNo. 10589的杂交瘤细胞株或其分泌产生的百日咳FHA抗原单 克隆抗体在制备百日咳疫苗中的应用。
[0035] 本发明提供了所述单克隆抗体在百日咳疫苗质量检测中的应用。
[0036] 本发明还提供所述单克隆抗体在检测百日咳杆菌FHA抗原含量中的应用。
[0037] 本发明具有以下优点和效果：
[0038] 1、本发明采用百日咳全菌体作为免疫原进行免疫，保证抗原决定簇的完整性和的 高免疫原性，筛选得到了能够稳定分泌特异性针对百日咳杆菌FHA抗原的单克隆抗体的杂 交瘤细胞株。
[0039] 2、本发明的百日咳杆菌FHA抗原单克隆抗体腹水，具有较高的效价，效价高于108， 同时具有较好的特异性，可以用于FHA抗原纯化过程中各个工序段含有FHA组分样品中FHA 抗原含量的检测，也可用于DTaP疫苗成品以及其他混合成分中的FHA抗原含量的测定。同 时，该单抗可以用于灵敏度更高的双抗体夹心ELISA检测方法，检测各种含有FHA抗原的样 品中FHA抗原的含量，大大提高疫苗生产过程中质控的特异性和效率，降低实验成本。
【具体实施方式】
[0040] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不用来限制本发明的范围。在不背离本 发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的 范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用 试剂、培养基、菌株、细胞等均为市售商品。
[0041] 实施例1免疫原制备与动物免疫
[0042] (1)采用包姜培养基，发酵百日咳杆菌58003菌株（来源于中国医学细菌保藏管理 中心）的菌体。
[0043] (2)发酵后，在发酵菌体中加入甲醛溶液至终浓度为0. 5%进行杀菌。
[0044] (3)4000rpm以上离心10分钟以上，弃掉上清，收集菌体，菌体采用PBS/0. 5%甲醛 吹悬。
[0045] (4)研磨菌体，研磨后用PBS/0. 5%甲醛重悬稀释。
[0046] (5)将上述重悬菌体与弗氏完全佐剂等体积混合，形成的乳化物于0天、14天、28 天免疫BALB/c小鼠，0? 2ml/只。
[0047] (6)末次免疫后一周采血检测抗体效价，若高于103,在采血1周后采用乳化物 〇.2yg/只进行腹腔冲击，3天后取小鼠脾脏，进行细胞融合。
[0048]