利用基于a蛋白的色谱增加蛋白纯度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供通过利用基于A蛋白的色谱降低样品中的蛋白聚集体水平来增加包 含Fc的蛋白的纯度的方法，所述基于A蛋白的色谱采用基于A蛋白的C结构域的A蛋白配 体。
【背景技术】
[0002] 蛋白纯化的常规方法通常包括细胞培养方法，例如利用重组工程化的哺乳动物或 细菌细胞系产生所关注的蛋白，然后是：(a)用于去除细胞和细胞碎片的澄清步骤，例如利 用差速离心和/或过滤；以及（b) -个或多个下游色谱步骤以便将所关注的蛋白与澄清的 细胞培养进料中的各种杂质分开。
[0003] 蛋白聚集体或高分子量蛋白物质是需要从包含所关注的产物（例如，包含Fc的蛋 白或抗体分子）的生物制药制品去除的重要杂质之一。例如，在产物可以用于诊断、治疗或 其他应用之前，必须从包含所关注的产物的生物制药制品去除蛋白聚集体和其他污染物。 在治疗应用以及获得食品和药物管理局批准的情况下这特别重要。
[0004] 在单克隆抗体和包含Fc的蛋白的情况下，纯化过程的行业标准通常包括纯化过 程，其包括几个单元操作。重要步骤之一是纯化步骤，其采用称作A蛋白、分离自金黄色葡 萄球菌（Staphylococcusaureus)并结合抗体的Fc区的亲和配体。通常，蛋白聚集体也结 合A蛋白柱，并且常最终在与包含Fc的蛋白相同的洗脱混合物（pool)中。
[0005] 去除蛋白聚集体是具有挑战性的，因为蛋白聚集体和生物制药制品中所关注的产 物（其一般为单体分子）的物理和化学特性之间有相似性。在包含Fc的蛋白的情况下，A蛋白色谱之后，下游可以使用一种或多种不同方法以从生物制药制品去除蛋白聚集体，包 括例如大小排阻色谱、离子交换色谱和疏水相互作用色谱。
[0006] 以前已报道在A蛋白色谱步骤期间通过利用pH梯度洗脱可以去除一些蛋白聚 集体。参见例如，PCT公开TO2011/028753 和Panetal.，AnalyticalBiochemistry 388 (2009) 273-278,其援引加入本文。但是，如这些参考文献中讨论的，洗脱包含Fe的蛋白 之后或同时，蛋白聚集体从A蛋白柱洗脱掉。
【发明内容】
[0007] 相对于以前描述的方法，本发明提供全新且改良的从含有包含Fc的蛋白的样品 去除更大量的蛋白聚集体的方法。本文所述的方法采用基于A蛋白的C结构域的A蛋白配 体，并且使用pH梯度洗脱或pH分步洗脱，使得除了在洗脱包含Fc的蛋白之后去除蛋白聚 集体，在洗脱包含Fc的蛋白之前洗脱至少30%的蛋白聚集体。由此，相对于现有技术描述 的方法，本文所述的方法使得总体上更大地去除蛋白聚集体，现有技术描述的方法主要在 洗脱包含Fc的蛋白之后去除蛋白聚集体。
[0008] 本发明至少部分是基于新的和意外的发现，通过使包含Fc的蛋白结合至固定的 基于A蛋白的C结构域的A蛋白配体，并且如本文所述，利用pH梯度方法或pH分步方法， 除了在洗脱包含Fe的蛋白之后去除蛋白聚集体，在洗脱包含Fe的蛋白之前去除至少30% 的蛋白聚集体。比现有技术方法去除更大量的蛋白聚集体不仅实现洗脱混合物中包含Fe 的蛋白增加的纯度，而且还减少可以用来去除这类蛋白聚集体的一个或多个额外的下游步 骤的负荷。在一些实施方案中，本文所述的方法减少去除蛋白聚集体的下游步骤的数量，或 者A蛋白步骤之后不需要使用一个或多个下游步骤以从洗脱混合物去除蛋白聚集体。
[0009] 在一些实施方案中，本发明提供一种降低含有包含Fe的蛋白的洗脱混合物中的 蛋白聚集体水平的方法，所述方法包括以下步骤：提供含有包含Fe的蛋白以及蛋白聚集体 的样品；使所述样品与固定在固体支持物上的A蛋白配体接触，其中所述A蛋白配体是基于 A蛋白的C结构域，从而包含Fe区的蛋白结合至所述A蛋白配体；利用pH梯度方法获得含 有包含Fe的蛋白的洗脱混合物，所述pH梯度方法采用高pH缓冲液和低pH缓冲液；其中除 了洗脱包含Fe的蛋白之后去除的蛋白聚集体，在洗脱包含Fe的蛋白之前去除至少30%的 蛋白聚集体，从而降低洗脱混合物中的蛋白聚集体水平。
[0010] 在一些实施方案中，本发明提供一种降低含有包含Fe的蛋白的洗脱混合物中的 蛋白聚集体水平的方法，所述方法包括以下步骤：提供含有包含Fe的蛋白以及蛋白聚集体 的样品；使所述样品与固定在固体支持物上的A蛋白配体接触，其中所述A蛋白配体是基于 A蛋白的C结构域，从而包含Fe区的蛋白结合至所述A蛋白配体；利用pH分步方法获得含 有包含Fe的蛋白的洗脱混合物，所述pH分步方法采用以递减的pH值次序顺序使用的两种 或更多种缓冲液，其中除了洗脱包含Fe的蛋白之后去除的蛋白聚集体，在洗脱包含Fe的蛋 白之前去除至少30%的蛋白聚集体，从而降低洗脱混合物中的蛋白聚集体水平。
[0011] 在一些实施方案中，利用pH分步方法获得洗脱混合物，所述pH分步方法采用pH 值降序的一系列小pH变化步骤。在一些实施方案中，每个小pH变化为0. 1-0. 5的等级 (order)。在一具体实施方案中，每个小pH变化为0. 2的等级。
[0012] 在一些实施方案中，系列的小pH变化步骤包括2个或更多个步骤，或者3个或更 多个步骤，或者4个或更多个步骤，或者5个或更多个步骤，或者6个或更多个步骤，或者7 个或更多个步骤，或者8个或更多个步骤，或者9个或更多个步骤，或者10个或更多个步 骤。在一具体实施方案中，使用的系列pH变化步骤的次序为：pH5. 0;pH4. 8;pH4. 6;pH 4. 4;pH4. 2;pH4. 0;pH3. 8;pH3. 6;pH3. 4;pH3. 2 ;和pH3. 0。
[0013] 在本发明的一些实施方案中，本发明提供一种增加包含Fe的蛋白的纯度的方法， 所述方法包括以下步骤：提供含有包含Fe的蛋白以及蛋白聚集体的样品；使所述样品与固 定在固体支持物上的A蛋白配体接触，其中所述A蛋白配体是基于A蛋白的C结构域，并且 其中包含Fe的蛋白结合至所述A蛋白配体；以及利用pH梯度洗脱方法或pH分步方法获得 含有包含Fe的蛋白的洗脱混合物，其中除了洗脱包含Fe的蛋白之后去除的蛋白聚集体，在 洗脱包含Fe的蛋白之前去除至少30%的蛋白聚集体，从而增加洗脱混合物中的包含Fe的 蛋白的纯度。
[0014]在一些实施方案中，A蛋白包含SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。在其他实施方 案中，A蛋白包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
[0015] 本文所述方法的一些实施方案，在洗脱的pH梯度方法的情况下，高pH缓冲液具有 约6. 0的pH，而低pH缓冲液具有约3. 0的pH。
[0016] 在本文所述方法的一些实施方案中，在洗脱的pH分步方法的情况下，至少一种使 用的缓冲液具有3. 6-4. 4的pH。
[0017] 在一些实施方案中，本文所述的分步洗脱方法采用一系列小pH变化步骤，其中pH 步骤范围从约5. 0的高pH至约3. 0的低pH，每个pH步骤与前一pH步骤差异为0. 1、0. 2、 0. 3、0. 4或0. 5的pH。在一具体实施方案中，以下列顺序使用小pH变化步骤：5. 0 ;4. 8 ;4. 6 ; 4. 4 ;4. 2 ;4. 0 ;3. 8 ;3. 6 ;3. 4 ;3. 2 ;和 3. 0。
[0018] 在一些实施方案中，所述包含Fe的蛋白为抗体或Fe融合蛋白。在一些实施方案 中，所述抗体为单克隆抗体。
[0019] 在一些实施方案中，在pH梯度洗脱的情况下，pH梯度跨越5个柱体积至30个柱 体积。
[0020] 用于固定A蛋白的示例性固体支持物包括但不限于可控孔度玻璃、二氧化硅、氧 化锆、氧化钛、琼脂糖、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醚、聚乙烯醇和聚 苯乙烯以及它们的衍生物。
【附图说明】
[0021] 图IA示出用pH梯度洗脱自3种树脂（A-MabSelectSure?;B-树脂A和C-树脂 C)的mAb-1(装载密度12mg/mL)的色谱图洗脱区，其中X-轴代表柱体积（CV)，左侧Y-轴是 UV280吸光度（mAU，实线），而右侧Y-轴是通过SEC确定的每个部分中聚集体物质的百分 比（连接的正方形）。树脂A和树脂B在峰前去除的蛋白聚集体的量显著高于MabSelect SuRe?，这表明在特征谱开始时更有效的聚集体物质去除。对于全部3种树脂，在洗脱特征 谱的末端部分中也获得了大量的聚集体物质，正如以前对MabSelectSure?报道的。
[0022] 图IB示出利用pH梯度洗脱自MabSelect SuRe?(通过菱形示出）、树脂A(通过 正方形示出）和树脂B(通过三角形示出）的mAb-1(装载密度12mg/mL)的收率对单体纯 度。树脂A和树脂B获得比MabSelect SuRe?高水平的单体纯度，同时保持高收率。
[0023] 图2示出对MabSelect SuRe?和树脂A洗脱部分获得的代表性SEC特征谱。X-轴 代表时间，而Y-轴是在280nm处的UV吸光度。示出进料特征谱（通过黑色实线示出），以 及来自洗脱特征谱的早期部分（峰前，通过灰色虚线示出）、洗脱特征谱的中间（通过黑色 虚线示出）和洗脱峰的晚期部分（峰后，通过点线示出）的部分。基于单体峰（8-9分钟） 将峰归一化并比对。对于MabSelect SuRe?，在特征谱末端洗脱的部分中观察到更大量的 聚集体去除。对于树脂A，在峰前和峰后部分中观察到更大量的聚集体去除。
[0024]图 3 示出用pH梯度洗脱自 5 种树脂（A-MabSelect Sure?;B-Pr〇Sep_?Ultra Plus;C-树脂A;D-树脂B;和E-树脂C)的mAb-2 (装载密度12mg/mL)的色谱图洗脱区，其 中X-轴代表柱体积（CV)，左侧Y-轴是UV280吸光度（以mAU测量并通过实线示出），而右 侧Y-轴是通过SEC确定的每个部分中聚集体物质的百分比（通过连接的正方形示出）。在 树脂A和树脂B的峰前中去除的聚集体的量显著高于MabSelectSuRe?、⑩Ultra Plus或树脂C。
[0025] 图4示出用pH梯度洗脱自3种树脂（A-MabSelectSure?;B-树脂A和C-树脂 C)的mAb-2 (装载密度40mg/mL)的色谱图洗脱区，其中X-轴代表柱体积（CV)，左侧Y-轴 是UV280吸光度（以mAU测量并通过实线示出），而右侧Y-轴是通过SEC确定的每个部分 中聚集体物质的百分比（通过连接的正方形示出）。
[0026] 图5示出用pH分步洗脱自3种树脂（A-MabSelectSure?;B-树脂A和C-树脂 C)的mAb-2 (装载密度12mg/mL)的色谱图洗脱区，其中X-轴代表柱体积（CV)，左侧Y-轴 是UV280吸光度（以mAU测量并通过实线示出），而右侧Y-轴是通过SEC确定的每个部分 中聚集体物质的百分比（通过连接的正方形示出）。
[0027] 图6示出mAb-3的色谱图，其使用树脂A，采用一系列小pH变化步骤用于洗脱，每 个pH步骤与前一pH步骤的差异为0. 2的值。图6a示出利用一系列小pH变化步骤的mAb-3 洗脱的色谱图，其中X-代表柱体积（CV)，左侧Y-轴为UV280吸光度（以mAU测量），而右 侧Y-轴为pH，其中小pH变化步骤为：pH5. 0;pH4. 8;pH4. 6;pH4. 4;pH4. 2;pH4. 0;pH 3. 8;pH