3-((2-(二甲氨基)乙烷基)(甲基)氨基)丙酸的两亲性衍生物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种3-((2-(二甲氨基）乙烷基）（甲 基）氨基）丙酸的两亲性衍生物及其用途。
【背景技术】
[0002] 基因治疗（gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因 缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。在过去的二十多年间，基因治疗在很多疾病治疗 领域将研究从临床前推向了临床，对于由基因异常引起的，医药界至今难以解决的疾病如 肿瘤等具有无可替代的优势。常见的基因药物有质粒DNA (plasmid DNA，pDNA)、反义寡核苷 酸（antisense 0DN)、小干扰RNA(siRNA)和小发卡RNA(shRNA)。具有RNAi干扰效应，能特 异性沉默目的基因的siRNA是目前基因治疗研究的重点。
[0003] siRNA (Small interfering RNA)，又称为小干扰RNA，是长度20到25个核苷酸的 双链RNA。通过与之序列互补的mRNA相结合，促使mRNA降解，介导转录水平的基因表达抑 制，从而诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。siRNA的调控机制是通过互补配对来对相应 靶位基因的表达进行沉默，因此具有高度的特异性。所以将其作为治疗药物，具有广阔的发 展前景，对于恶性肿瘤、HIV等一系列病症的治疗具有重大意义。
[0004] 基因治疗的关键是将基因药物体内输送到靶细胞，使其发挥作用。然而，将外源基 因引入体内，其会被体内的核酸酶降解，在未进入靶细胞之前，便被降解成小分子核苷酸， 从而失去治疗作用。因此，实现基因治疗的关键是高效、安全的基因递送系统。
[0005] 基因载体在运送基因的时候要经历多个复杂的过程：通过血液循环到达靶细胞， 细胞摄取，内涵体的逃逸，胞内运动，载体释放基因物质。其主要障碍主要是复杂血液环境 的细胞外障碍和溶酶体酶降解的细胞内障碍。因此寻找良好的基因载体，使得靶基因到达 靶点发挥效用，是基因载体研究者亟待解决的问题。
[0006]目前，在基因输送载体系统方面主要分为两大类：一是病毒载体系统；二是非病 毒载体系统。病毒载体是一种天然的载体资源，病毒基因组结构简单，转染效率高，靶细胞 特异性强，但其导向性差、携带能力低、免疫原性和潜在致瘤性的局限性，使其难以达到临 床应用的要求。因此多样性、无免疫原性及易于控制生产的非病毒载体系统近年来备受关 注，并在很多治疗领域有所应用。常用的非病毒载体系统主要是脂质（cationic lipids)载 体。
[0007] 阳离子脂质的正电荷通过静电作用与带负电的基因药物结合，从而将基因物质浓 缩包装成较小粒径的粒子。带正电的阳离子脂质体可以将基因药物siRNA浓缩装载成粒径 较小的纳米粒子。阳离子脂质体在基因输送载体制备和细胞转染方面显示出了其他类型脂 质体无法比拟的优势。复合物较小的粒径降低了被体内巨嗜细胞识别、吞噬、清除的机会， 提高了药物的体内生物利用度。同时，针对于肿瘤组织，复合物较小粒径更容易利用渗透和 滞留效应从血管内皮细胞间隙透过进入肿瘤实质，增加在肿瘤组织的药物聚集。在转染方 面，由于细胞表面略微带有负电，带正电的脂质体更容易吸附到细胞表面，通过内吞等机制 进入细胞，大大增加了脂质体的转染能力。
[0008] 目前阳离子脂质作为基因载体因其结构简单、操作简便、生物安全性高等特点成 为了目前应用最为广泛的非病毒载体，但大部分制备过程复杂，不易进行放大生产。因此本 发明尝试利用3-((2-(二甲氨基）乙烷基）（甲基）氨基）丙酸，以其为结构基础，将其两 亲性衍生物作为基因药物的载体系统。此类衍生物合成步骤简单，原材料简单易得，同时， 能较好递送基因药物，成功解决了上述问题，达到了较好的基因治疗效果。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺点，提供一种3- ((2-(二甲氨基） 乙烷基）（甲基）氨基）丙酸的两亲性衍生物及其用途。该衍生物是基于3-((2-(二甲氨 基）乙烷基）（甲基）氨基）丙酸结构为基础的一系列两亲性衍生化合物。本发明的两亲性 衍生化合物的含氮头基在不同pH下具有不同的电离状态，其中在较低pH下，如pH4-5,其带 正电。从而其制备而成的胶束及脂质体，可以与带负电的基因药物复合，能形成粒径较小， 分布均匀的复合物纳米粒子。同时，化合物的含氮头基在PH7. 4条件下不带电或带负电，这 样使得复合物在PH7. 4环境下不带电或带负电，降低了与体内血液环境中带负电蛋白吸附 的机会，增加了脂质复合物的体内稳定性，减小因过多正电荷引起的细胞毒性。本发明提供 的脂质体，可将荧光素酶siRNA体外高效递送到人非小细胞肺癌H1299-Pgl3细胞内，特异 性抑制基因表达。同时载体系统可以体内特异性转载荧光基因药物进入正常小鼠肝脏细 胞。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0011] 第一方面，本发明涉及一种3- ((2-(二甲氨基）乙烷基）（甲基）氨基）丙酸的两 亲性衍生物，其结构式如式（I )所示：
烃基，R2为长碳链烷基或烷烃基。也可以表示为：Rl为碳链或亚油酸链，R2为碳链或亚油 酸链。其结构如具有以下特点：二甲氨基乙烷基_(甲基）氨基_(CH2)n_酯键-Rland R2。
[0013] 优选地，所述Rl为含12~18个碳原子的长碳链烷基或烷烃基，R2为含12~18 个碳原子的长碳链烷基或烷烃基。
[0014] 更优选地，所述Rl为第九个碳原子位置上为双键或第九、十二个碳原子位置上为 双键的长碳链烷烃基。
[0015] 更优选地，所述R2为第九个碳原子位置上为双键或第九、十二个碳原子位置上为 双键的长碳链烷烃基。
[0016] 上述两亲性衍生物包括含如下结构的各物质：
[0017]
[0022] 第二方面，本发明涉及一种上述的两亲性衍生物的制备方法，所述方法包括如下 步骤：
[0023] A、在四氢呋喃催化剂、红铝溶液的甲苯溶液存在的条件下，含碳原子16-18的直 链脂肪酸在室温下发生还原反应，得中间产物醇2 ;
[0024] B、在三乙胺、4-二甲氨基吡啶、甲烷磺酸酐催化剂的作用下，中间产物醇在20°C 下发生磺酸酯化反应得到中间产物3 ;
[0025] C、在二甲基甲酰胺、溴化锂催化剂作用下，中间产物3在45°C下反应得到中间溴 化物4 ;
[0026] D、在镁、无水乙醚、甲酸乙酯催化剂作用下，中间产物4在40°C发生格式反应生成 中间产物5 ;
[0027] E、在氢氧化钠、四氢呋喃作用下，中间产物5在65°C下发生水解反应生成中间产 物6 ;
[0028] F、在N，N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰 二亚胺盐酸盐催化剂作用下，中间产物6在50°C下发生酯化反应产生中间产物8 ;
[0029] G、在二甲基甲酰胺、碘化钠、碳酸钾的催化剂作用下，中间产物8在80°C下与N、N、 N' -乙二胺发生氨基化反应，即得所述两亲性衍生物。
1-7中任一整数，且第6个碳原子处为单键或双键，第9个碳原子处为单键或双键。
[0031] 第三方面，本发明涉及一种含上述的两亲性衍生物的脂质体，所述脂质体包括所 述两亲性衍生物、胆碱、胆固醇；所述脂质体中胆碱的重量百分比含量为20%~50%，胆固 醇的重量百分比含量为10 %~30%。
[0032] 优选地，所述胆碱为二棕榈酰磷脂酰胆碱。
[0033] 第四方面，本发明涉及一种上述的脂质体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0034] A、将所述两亲性衍生物的乙醇溶液、胆碱乙醇溶液、胆固醇乙醇溶液混合，形成脂 质乙醇溶液；
[0035] B、将所述脂质乙醇溶液加入到pH〈5. 0的HEPES缓冲液中，搅拌，制得脂质体混悬 液；
[0036] C、将所述脂质体混悬液在pH〈5. 0的HEPES缓冲液透析，去除乙醇；即得所述脂质 体。
[0037] 步骤B中，脂质体混悬液中含30wt. %乙醇。步骤C中，透析是在4°C下透析4h。
[0038] 第五方面，本发明涉及一种上述的脂质体在制备基因药物输送载体中的用途，所 述脂质体包载DNA、RNA、透明质酸或多肽。所述基因药物为DNA、RNA、透明质酸或多肽。该 脂质体具有帮助基因药物穿过细胞外障碍和细胞内障碍的能力。
[0039] 第六方面，本发明涉及一种脂质/基因复合物，所述脂质/基因复合物是由上述的 脂质体包载基因生物分子而组成的。其包封率在30%以上。该基因生物分子包括DNA、RNA、 透明质酸或多肽。
[0040] 第七方面，本发明涉及一种上述的脂质/基因复合物的制备方法，所述方法包括 如下步骤：
[0041] A、将所述两亲性衍生物的乙醇溶液、胆碱乙醇溶液、胆固醇乙醇溶液混合，形成脂 质乙醇溶液；
[0042] B、将所述脂质乙醇溶液加入到pH〈5. 0的HEPES缓冲液中，搅拌，制得脂质体混悬 液；
[0043] C、在所述脂质体混悬液中加入基因生物分子的DEPC水溶液，37°C孵育l_2h ;
[0044] D、在pH〈5. 0的HEPES缓冲液透析，去除乙醇；继续在PBS溶液透析，调整体系pH 至中性，即得所述脂质/基因复合物。
[0045] 步骤B中，脂质体混悬液中含30wt. %乙醇。步骤D中，在HEPES缓冲液中透析是 在4°C下透析4h ;在PBS溶液中透析是在4°C下透析12h ;其中PBS溶液的pH值为7. 4。步 骤D中，优选调整体系pH至7. 4。
[0046] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0047] (1)本发明基于3-((2-(二甲氨基）乙烷基）（甲基）氨基）丙酸结构为基础，制 备的两亲性衍生化合物，从而改善优化了传统基因递送系统合成步骤复杂，不易放大生产 的问题；
[0048] (2)本发明的两亲性衍生物制备