酵母融合菌混菌剂及其制备方法和生产有机肥的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酵母融合菌混菌剂及其制备方法和发酵秸杆畜禽便生产生物有机肥的方法。
【背景技术】
[0002]传统的微生物混菌剂制备所用的微生物菌种大多是从国家或地方菌种库或直接从自然界分离筛选出来的，其缺点是:1、微生物菌种的活性差；2、对有机物分解转化能力弱；3、这些菌种所制备的混菌剂活细胞数少，大多数在108个/克
[0003]传统的微生物混菌剂制备方法是将各种不同的菌种(好氧或厌氧)在各自不同的生长培养基中进行培养，然后再从各个菌种的培养基中刮取菌苔制成各个菌种的液体菌悬液，再转种于各自的液体培养基中，经通气或厌氧培养后离心沉淀制备菌体细胞沉淀物，将沉淀物再经喷雾干燥制成菌粉，然后将制备的各菌菌粉按不同比例混合，即为混菌剂。其缺点是:制备工艺复杂，培养菌周期长，成本高，活性差，应用受到限制。
[0004]传统的秸杆畜禽便生产有机肥的方法，是利用原料中的土著微生物来自然发酵降解有机物，但由于在制肥初期土著微生物的数量较少，这些微生物需经较长时间才能繁殖起来，并且，它们对有机物分解速度差异性也很大，因此，传统的秸杆畜禽便制肥方法周期很长，产生臭味大，且肥效低。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种酵母融合菌混菌剂。
[0006]本发明的又一目的在于提供一种酵母融合菌混菌剂制备方法。
[0007]本发明的还有一目的在于提供一种酵母融合菌混菌剂发酵秸杆畜禽便生产生物有机肥的方法。
[0008]尤其是利用基因工程技术对酵母菌进行原生质体融合制备新的酵母融合菌，用该酵母融合菌与地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌配伍制备混合菌剂的方法。并利用所述的酵母融合菌混菌剂对农业秸杆和畜禽便进行发酵生产生物有机肥，是一项将农业废弃物中的有机物进行快速生物转化的技术，是实现了废弃物利用变废为宝的技术目的。
[0009]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种酵母融合菌混菌剂，其主要特点在于该混菌剂包括菌体和培养基:其中所述的菌体包括酵母融合菌(Fusant betweenCandida tropicalisand Saccharmycescevisiae)F105,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2014年12月30日，保藏编号为CGMCC N0.10263 ;地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)B-36购自中国农业微生物菌种保藏中心编号为Acccll080 ;圆褐固氮菌(Azotobacter chroococum) LGN-09保藏在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2010年4月26日，保藏编号为CGMCC N0.3768、链霉菌(Str^tomyces)S-1l购自中国农业微生物菌种保藏中心编号为ACCC40044和康氏木霉菌(T.reesi)T_2为市场销售菌；其中所述酵母融合菌的活菌数为总活菌数的25-40%，地衣芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30%，圆褐固氮菌的活菌数为总活菌数的15-30%，链霉菌的活菌数为总活菌数的15-30%。康氏木霉菌的活菌数为总活菌数的10-35%。
[0010]所述的酵母融合菌混菌剂，还包括有混菌液体培养基及液体菌种的制备，在一升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵l-2g，碳酸钙l_2g，磷酸0.5-lml，用1%石灰水调PH6.2-7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112°C，30-35分钟高压灭菌，冷却后分别取酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的琼脂斜面试管菌种在无菌条件下分别转种于液体三角烧瓶培养基中，经28-32°C，24-72h静置或上摇床振荡培养，或在发酵罐通气搅拌发酵培养，将其发酵菌液按其不同比例配制，即为酵母融合菌混菌剂。
[0011]所述的酵母融合菌混菌剂，所述的酵母融合菌的制备有如下步骤:将酒精酵母菌作母种的斜面菌转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用I %的纤维素酶和I %蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33°C，得到酒精酵母原生质体；将热带假丝酵母菌作母种的斜面菌转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用Η)ΤΑ-巯基乙醇进行预处理，使用1.5%的纤维素酶和0.5%蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33°C，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1%碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1:1混合，将沉淀悬于35%聚乙二醇的促溶剂中，30°C水浴静止处理，pH6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液反复冲洗，涂布于高渗基础培养基和高渗完全培养基平板培养基上，经30°C、7天培养，平板生长出酵母融合菌。
[0012]所述的酵母融合菌混菌剂，所述的圆褐固氮菌的制备有如下步骤:
[0013](I)采样:圆褐固氮菌是从兰州市南北两区地区的暗灰钙土，淡灰钙土，红泥土和碱土的四种不同土壤类型和多个植物根区的0-10cm、10-20cm、20-30cm 土壤深度的266份土样;
[0014](2)分离培养:取1g新鲜土样加入盛有10ml无菌水的500ml三角烧瓶中，放摇床上振荡1min使土样均勾的分散在稀释液中成为土壤悬液，吸取Iml上清液加到9ml无菌水中，按10倍法依次稀释至10 4-10 6，各重复四次；在已灭菌的培养皿中倾注15-20ml阿须贝(Ashby)的固体琼脂培养基，待凝固后用移液枪吸取10ul 土壤稀释液加到培养基表面，然后立即用涂布棒将稀释液涂抹均匀；用相同的方法将同一样本不同稀释度的稀释液从高稀释度到低稀释度依法涂抹；将接种稀释的培养皿倒置放在28-32°C恒温培养箱内培养2-3d后取出，挑取具有特征性的水溶性褐色色素，光滑凸起的圆褐固氮菌菌落，转种在阿须贝琼脂斜面试管培养基上，经28-32°C恒温培养2-3d，取出后即为圆褐固氮菌母钟，保存在4-8 °C冰箱内备用。
[0015](3)诱变:将母种再经紫外线(30s)，亚硝基胍(NTG)诱变处理以及生化形态学鉴定，最后鉴定获得的菌种转种于阿须贝琼脂斜面试管培养基上，即得保藏菌种。
[0016]所述的酵母融合菌混菌剂的制备方法，其主要特点在于有如下步骤:
[0017]A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养:
[0018]a.酵母融合菌酵母膏琼脂斜面培养基的制备:
[0019]酵母膏0.5-2 %、葡萄糖0.5-2 %、蛋白胨0.2-0.6 %、琼脂粉1_3 %、无菌水80-120ml，加热溶解后用I %的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114°C，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15*1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用:
[0020]b.地衣芽孢杆菌营养牛肉膏琼脂斜面培养基的制备:
[0021 ] 蛋白胨含量重量百分比为0.25-1 %，氯化钠的含量重量百分比为0.25-1 %，牛肉膏的含量重量百分比为0.2-0.5%，琼脂粉的含量重量百分比为1_3%，其余为无菌水，该培养基的PH为6.5-7.5 ;
[0022]c.圆褐固氮菌阿须贝(Ashby)琼脂斜面培养基的制备:
[0023]甘露醇的含量重量百分比为0.8-1.2%，碳酸钙的含量重量百分比为0.2-0.8%,磷酸二氢钾的含量重量百分比为0.01-0.03%，硫酸镁(含七个结晶水)的含量重量百分比为0.01-0.03%，氯化钠的含量重量百分比为0.01-0.03%，硫酸钙(含两个结晶水)的含量重量百分比为0.005-0.015%，琼脂粉的含量重量百分比为1_3%，其余为无菌水，该培养基的PH为6.8-7.0 ；
[0024]d.链霉菌和康氏木霉菌马铃薯-蔗糖(PDA)琼脂斜面培养基的制备:
[0025]马铃薯的含量重量百分比为15-25%，蔗糖的含量重量百分比为1.5-2.5%，琼脂粉的含量重量百分比为1_3%，其余为无菌水该培养基的PH为5.5-6.5.
[0026]对以上酵母融合菌，地衣芽孢杆菌，圆褐固氮菌，链霉菌和康氏木霉菌五种菌，分别取母钟转种各自制备的固体试管斜面培养基上，经培养为一级菌种；
[0027]B液体培养基及液体菌种的制备
[0028]a液体培养基的制备:在一升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸钱l-2g，碳酸I丐l_2g，磷酸0.5-lml，用I %石灰水调pH6.2-7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112°C，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用;
[0029]b分别取酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的一级菌种，在无菌条件下分别转种于液体三角烧瓶培养基中，经28-32°C，24-72h静置培养。其培养菌液为二级菌种；
[0030]c分别将酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、链霉菌和康氏木霉菌的二级菌种，在无菌条件下转种于液体三角烧瓶培养基中，上摇床进行震荡培养，振幅100-120转/分钟，温度28-32°C时间24-72h，其培养液为三级菌种，根据需要继续逐级扩大培养；
[0031]d分别将重量百分比为酵母融合菌为25-40%、地衣芽孢杆菌15-30%、圆褐固氮菌15-30%、链霉菌15-30%、康氏木霉菌15-30%的三级菌种再扩大培养，五种液体菌可以同时转种在同一发酵罐中经28-32°C，18-24h通气搅拌发酵培养，其培养液为酵母融合菌混菌剂。
[0032]—种酵母融合菌混菌剂发酵秸杆畜禽便生产生物有机肥的方法，其主要特点在于将秸杆粉碎小于10mm，加入重量份为30-40的秸杆，重量份为40-50份的畜禽便，重量份为6-10的米糠，重量份为1.7-2.0的尿素和重量份为1.7-2.0的硫酸铵后混合，将混合的物料调含水量到50-65%，按混合物料的总重量加入2-5%的酵母融合菌混菌剂和0.008-0.010%的复合酶，经充分搅拌均匀，控制发酵料含水量50-65%用I %的石灰水调PH到6.2-7.8然后将混合料放在发酵床或发酵池或堆积水泥地板上，在料堆上盖塑料布防止水分蒸发和保温，经常温发酵，并时常观察料温和翻拌，经10-20d待腐熟后，经干燥粉碎后或粉状或造粒包装即得生物有机肥产品。
[0033]所述的酵母融合菌混菌剂发酵秸杆畜禽便生产生物有机肥的方法，所述的秸杆包括稻草、玉米杆、小麦秸、高粱秸、谷草秸、黄豆秸、大麦秸、蚕豆秸、豌豆秸、荞麦秸、花生藤、马铃薯藤、瓜类藤的任意一种或任意组合
[0034]所述的酵母融合菌混菌剂发酵秸杆畜禽便生产生物有机