择性液体无氮液 体改良培养基内，持续光照强度为150yE/m2/s，光照周期为12:12h(光：暗周期），温度为 23-27°C，培养2周后，取5mL于灭菌的20mL小瓶中，盖上橡皮塞，瓶盖边缘以石蜡封口，用 注射器将lmL的乙炔注入20mL小瓶中，于30°C反应12h，然后取40yL反应后气体，待测； 每个实验组设三个重复。
[0028] 所述的选择性液体无氮液体改良培养基，其配方为：MgS04? 7H20, 0. 08g; CaCl20.04g;K2HP040.04g;NaHC030.04g;Fe-EDTA2ml;TA5 2ml;VB12 0.32ml，蒸馏水 500ml，灭菌海水1500ml，灭菌备用。
[0029]TracemetalmixA5 (TA5) :H3B032. 86g；MnCl24H20 1. 81g；ZnS047H200.222g； NaMo042H20 0.39g;CuS045H20 0.079g;Co(N03)26H20 49.4mg;Distilledwater1.0L，灭菌 备用。
[0030] 空白对照组：对照容器中加入乙炔气体但是不加入蓝藻，其他同实验组。
[0031] 所有样品用气相色谱检测乙烯的生成量。
[0032] 取40yL反应后气体在上海精科仪电气相色谱仪器（GC-112A)上测定乙烯峰值， 标准气乙烯的浓度为138ppm。气相色谱仪的工作条件设置为：检测室温度200°C，柱箱温 度60 °C，进样口 120 °C。表头载气压力氮气为0.95kg，cm2,氢气为0.8kg，cm2,空气为 0. 6kg?cm2。乙炔还原活性计算方法为：
[0033]ARA(nmolCH?H1 ?Culture:) =VstXCstXAsaXVtu/Vsa/Ast/H/22. 4
[0034] 其中，Vst是注入标准气的体积（ml)，Cst是标准气的浓度，Vtu是所用试管体积 (ml)，Asa是样品乙稀峰的面积（cm)，Vsa是样品注入体积（ml)，Ast是标准气峰面积（cm)， H是培养时间。
[0035] 检测结果表明本实施例分离纯化得到的纯菌株蓝藻SCSI0S3可以利用队作 为氮源，且具有较高的生物固氮活性，纯培养条件下平均固氮活性为2.8±0.66nmol N2yg^hlah:〇
[0036] 实施例2蓝藻吲哚乙酸产生量的测定
[0037] 测定采用salkowski比色法测定分离物产生植物生长激素类物质的能力，标准曲 线采用纯的3-IAA(3-吲哚乙酸）制作。将蓝藻SCSI0S3接种于100mL选择性液体无氮液 体改良培养基（配方同实施例1)内，持续光照强度为150yE/m2/s，光照周期为12:12h(光： 暗周期），温度为25-28°C，培养120h，每隔24h取蓝藻培养液上清5mL在10000r/min离 心10min，取上清液加比色液在黑暗中静止0.5h，取出，立即用分光光度计测定，波长是 530nm(GlickmannandDessauxY.A)〇
[0038] 样品中吲哚乙酸含量（yg/mg) = (AXV1V(WXV2)X1000
[0039] 式中：A--标准曲线上查得的IAA量（yg)
[0040] VI 样品提取液体积（mL)
[0041] ff--样品重量（g)
[0042] V2--样品反应液体积（mL)
[0043] 本发明获得的蓝藻SCSI0S3的3-IAA生成量约为10. 35±0. 64yg/mg。
[0044] 实施例3菌株的16SRNA和固氮基因扩增
[0045] 选择实施例1分离纯化得到的纯菌株蓝藻SCSI0S3进行DNA提取和纯化，本实施 例DNA的提取与纯化，其操作方法参考东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》P4M。采用固氮细 菌的 16S27F/1492R(Weisenburgetal.，1991，16SribosomalDNAamplificationfor phylogeneticstudy.Journalofbacteriology，1991 173(2) :697_703和nifH基因通用 引物PolF/PolR(参考Polyetal.，2001，ComparisonofnifHGenePoolsinSoilsand SoilMicroenvironmentswithContrastingProperties，AppliedandEnvironmental Microbiology, 2001，67 (5) :2255-2262)进行PCR扩增：PCR反应体系如表 1 所示。
[0046] 表1PCR反应体系
[0047]
[0048] PCR反应条件为：预变性 95°C5min;变性 95°C30s，退火 55°C30s，延伸 72°C40s， 共30个循环；后延伸72°C10min。
[0049] 取2y1PCR反应产物用1. 5 %的琼脂糖凝胶电泳检测，若有目的条带的出现，则 将剩余的PCR产物直接交与Invitrogen生物技术有限公司用ABIPrism3730XLDNA分 析系统测序，并将测序分析得到的16SrDNA(其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示）和固氮 基因序列nifH(其核苷酸序列如SEQIDN0. 2所示）通过GenBank中的BLAST与GenBank 数据库中的序列进行比对，对其种属鉴定进行初步的确定。建立系统发育树，系统发育树如 图1和图2所示，从系统发育树可以看出与蓝藻SCSIOS3的16SrDNA序列具有较近亲 缘关系的序列均来自鞘丝藻属，并且与已知菌种的伪鱼腥藻PseudanabaenatremulaUTCC 471 (AF218371)的16SrDNA序列具有91. 69%的相似性，固氮基因与鞘丝藻属的赖氏鞘氏 藻相似度最高，仅为91 %，表明该株蓝藻SCSI0S3为一株潜在新种，其属于伪鱼腥藻，将其 命名为伪鱼腥藻（Pseudanabaenasp.)SCSI0S3,其于2015年5月29日保藏于中国典型培 养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国?武汉?武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015342。
[0050] 实施例4蓝藻培养液在红树种子萌发和生根过程促生作用的有效性试验
[0051] 将用选择性液体无氮液体改良培养基（配方同实施例1)培养2周后的伪鱼腥 藻（sp.)SCSI0S3菌液的上清液，分别取出5mL加入含有红树林植物红海榄种子的培养 瓶中，其中对照组中仅仅只加入5mL的超纯水，各三个重复，然后将其放入培养箱中，置于 12h:12h光：黑暗周期（200iiE/m2/s)的光照强度，27°C培养，20天后，点数根的条数并且测 量根的长度，结果如表2所示。
[0052] 表2 :不同处理组的红海榄的根数和平均根长
[0053]
[0054] 如表2所示，通过实验组和对照组的生长20天后的实验结果对比可以发现，实验 组的生根数和平均根长度均明显高于对照组，根数约是对照组的2. 6倍和平均根长约为对 照组的2倍，显示了伪鱼腥藻（Pseudanabaenasp. )SCSI0S3对红树植物的生根具有较好 的促生效果，具有应用于红树林等海洋生态系统的修复和保护中的巨大潜力。
【主权项】
1?伪鱼腥藻（Pseudanabaena sp.) SCSIO S3,保藏编号：CCTCC NO :M 2015342。2. 权利要求1所述的伪鱼腥藻（Pseudanabaena sp.) SCSIO S3在制备促生固氮菌肥中 的应用。3. 权利要求1所述的伪鱼腥藻SCSIO S3在制备3-吲哚乙酸中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株伪鱼腥藻SCSIO？S3及其应用。本发明提供一株从中国海南省陵水新村湾海草海菖蒲(Enhalus？acodoides)叶片上分离获得的蓝藻新种SCSIO？S3，其于2015年5月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其具有较高的固氮生物活性并能够产生植物生长激素吲哚乙酸的蓝藻新种，由此该伪鱼腥藻(Pseudanabaena？sp.)SCSIO？S3在海洋微生物肥力制备方面具较高的价值和广阔的应用前景。CCTCC NO：M 201534220150529
【IPC分类】C12N1/20, C05F11/08, C12R1/89, C12P17/10
【公开号】CN105112321
【申请号】CN201510467840
【发明人】凌娟, 张燕英, 张渊洲, 杨清松, 董俊德, 江玉凤, 曾思泉
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月31日