产物、EHNV的PCR产物、IPNV的PCR 产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物。
[0135]将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳（图6)，结果表明，只有VHSV的PCR产 物中有205bp的条带，表明VHSV-P只有以VHSV的RNA为模板才能扩出目的条带。
[0136] 2. 2焦磷酸测序
[0137] 按照实施例3步骤1中1. 2的焦磷酸测序的方法，分别以VHSV-S为测序引物对本 实施例步骤2的2. 1得到的VHSV的PCR产物、SVCV的PCR产物、IHNV的PCR产物、EHNV的 PCR产物、IPNV的PCR产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物进行测序。 结果显示，只有VHSV的PCR产物的测序结果有如图3所示的测序峰型，其余的PCR产物均 没有图3所示的测序峰型，表明只有VHSV的PCR产物含有VHSV指纹序列，其余的PCR产物 均不含VHSV指纹序列。
[0138] 结果表明，VHSV-P及VHSV-S可特异识别VHSV。
[0139] 3、IHNV-P与IHNV-S的特异性
[0140] 3. 1PCR扩增
[0141] 50yLPCR扩增体系：实施例 3 的IHNV总RNA2yL，5XPCRbuffer10yL，5U/ yLTaq热启动酶 0? 25yL，浓度为lOpmol/yL的IHNV-P-F0? 5yL，浓度为lOpmol/yL的 IHNV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0142] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后得到IHNV的PCR产物。
[0143] 按照上述方法，将实施例3的IHNV总RNA分别替换为实施例3的SVCV总RNA、 VHSV总RNA及上述EHNV总DNA、IPNV总RNA、HRV总RNA、VNNV总RNA和KHV总DNA，其他 步骤均不变，分别得到SVCV的PCR产物、VHSV的PCR产物、EHNV的PCR产物、IPNV的PCR 产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物。
[0144] 将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳（图7)，结果表明，只有IHNV的PCR产 物中有61bp的条带，表明IHNV-P只有以IHNV的RNA为模板才能扩出目的条带。
[0145] 3. 2焦磷酸测序
[0146] 按照实施例3步骤1中1. 2的焦磷酸测序的方法，分别以IHNV-S为测序引物对本 实施例步骤3的3. 1得到的IHNV的PCR产物、SVCV的PCR产物、VHSV的PCR产物、EHNV的 PCR产物、IPNV的PCR产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物进行测序。 结果显示，只有IHNV的PCR产物的测序结果有如图4所示的测序峰型，其余的PCR产物均 没有图4所示的测序峰型，表明只有IHNV的PCR产物含有IHNV指纹序列，其余的PCR产物 均不含IHNV指纹序列。
[0147] 结果表明，IHNV-P及IHNV-S可特异识别IHNV。
[0148] 实施例5、SVCV-P、VHSV-P和IHNV-P的灵敏度实验
[0149]USVCV-P的灵敏度
[0150] 将实施例2步骤1的重载载体PMD18-T-SVCV用DEPC水进行稀释，分别得到1000 拷贝 /yL的PMD18-T-SVCV、100 拷贝 /yL的PMD18-T-SVCV、10 拷贝 /yL的PMD18-T-SVCV 和 1 拷贝 /yL的PMD18-T-SVCV。
[0151] 50yLPCR扩增体系：1000 拷贝/yL的PMD18-T-SVCVlyL，5XPCRbuffer 10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为 10pmol/yL的SVCV-P-F0.5yL，浓度为 lOpmol/yL的SVCV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0152] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后得到SVCV的1000拷贝PCR产物。
[0153] 按照上述方法，将1000拷贝/yL的PMD18-T-SVCV分别替换为100拷贝/yL的 PMD18-T-SVCV、10 拷贝 /yL的PMD18-T-SVCV、1 拷贝 /yL的PMD18-T-SVCV和DEPC水，其 他步骤均不变，分别得到SVCV的100拷贝PCR产物、SVCV的10拷贝PCR产物、SVCV的1拷 贝PCR产物和阴性对照PCR产物。
[0154] 将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳（图8)，结果显示，SVCV的1000拷贝 PCR产物、SVCV的100拷贝PCR产物、SVCV的10拷贝PCR产物和SVCV的1拷贝PCR产物 中均有138bp的条带，阴性对照PCR产物中无该条带，表明，SVCV-P最低能检测到浓度为1 拷贝/yL的SVCV，说明SVCV-P最低能检测到浓度为1个SVCV基因组拷贝数/yL(即3fg SVCV基因组/yL)。
[0155] 2、VHSV-P的灵敏度
[0156] 将实施例2步骤1的重载载体PMD18-T-VHSV用DEPC水进行稀释，分别得到1000 拷贝 /yL的PMD18-T-VHSV、100 拷贝 /yL的PMD18-T-VHSV、10 拷贝 /yL的PMD18-T-VHSV 和 1 拷贝 /yL的PMD18-T-VHSV。
[0157] 50yLPCR扩增体系：1000 拷贝 /yL的PMD18-T-VHSV1yL，5XPCRbuffer 10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为 10pmol/yL的VHSV-P-F0.5yL，浓度为 lOpmol/yL的VHSV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0158] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后得到VHSV的1000拷贝PCR产物。
[0159] 按照上述方法，将1000拷贝/yL的PMD18-T-VHSV分别替换为100拷贝/yL的 PMD18-T-VHSV、10 拷贝 /yL的PMD18-T-VHSV、1 拷贝 /yL的PMD18-T-VHSV和DEPC水，其 他步骤均不变，分别得到VHSV的100拷贝PCR产物、VHSV的10拷贝PCR产物、VHSV的1拷 贝PCR产物和阴性对照PCR产物。
[0160]将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳（图9)，结果显示，VHSV的1000拷贝 PCR产物、VHSV的100拷贝PCR产物、VHSV的10拷贝PCR产物和VHSV的1拷贝PCR产物 中均有205bp的条带，阴性对照PCR产物中无该条带，表明，VHSV-P最低能检测到浓度为1 拷贝/yL的VHSV，说明VHSV-P最低能检测到浓度为1个VHSV基因组拷贝数/yL(即5fg VHSV基因组/yL)。
[0161] 3、IHNV_P的灵敏度
[0162] 将实施例2步骤1的重载载体PMD18-T-IHNV用DEPC水进行稀释，分别得到1000 拷贝 /yL的PMD18-T-IHNV、100 拷贝 /yL的PMD18-T-IHNV、10 拷贝 /yL的PMD18-T-IHNV 和 1 拷贝 /yL的PMD18-T-IHNV。
[0163] 50yLPCR扩增体系：1000 拷贝/yL的PMD18-T-IHNVlyL，5XPCRbuffer 10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为 10pmol/yL的IHNV-P-F0.5yL，浓度为 lOpmol/yL的IHNV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0164] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后得到IHNV的1000拷贝PCR产物。
[0165] 按照上述方法，将1000拷贝/yL的PMD18-T-IHNV分别替换为100拷贝/yL的 PMD18-T-IHNV、10 拷贝 /yL的PMD18-T-IHNV、1 拷贝 /yL的PMD18-T-IHNV和DEPC水，其 他步骤均不变，分别得到IHNV的100拷贝PCR产物、IHNV的10拷贝PCR产物、IHNV的1拷 贝PCR产物和阴性对照PCR产物。
[0166] 将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳（图10)，结果显示，IHNV的1000拷贝 PCR产物、IHNV的100拷贝PCR产物、IHNV的10拷贝PCR产物和IHNV的1拷贝PCR产物 中均有61bp的条带，阴性对照PCR产物中无该条带，表明，IHNV-P最低能检测到浓度为1 拷贝/yL的IHNV，说明IHNV-P最低能检测到浓度为1个IHNV基因组拷贝数/yL(即6fg IHNV基因组/yL)。
[0167]实施例 6、依赖于SVCV-P与SVCV-S、VHSV-P与VHSV-S、IHNV-P与IHNV-S鉴定 SVCV、VHSV、IHNV的焦磷酸测序法与普通PCR鉴定SVCV、VHSV、IHNV的比较
[0168] 1、样品采集
[0169] 分别从山东烟台、山东莱州、山东龙口、山东青岛、广东深圳、上海、福建、江苏采集 不同品种的鱼的心、脾、肾、脑组织，共40个样品，即样品1-40,分别提取RNA，分别得到样品 1-40的总RNA，这40份样品的总RNA的浓度均为40ng/yL。
[0170] 2、焦磷酸测序法鉴定SVCV、VHSV和IHNV
[0171] 2. 1焦磷酸测序法鉴定SVCV
[0172] 按照如下PCR扩增体系进行焦磷酸测序法鉴定SVCV的PCR扩增：步骤1的 样品总RNA2yL(每个体系中加入一个样品的总RNA)，5XPCRbuffer10yL，5U/yL Taq热启动酶 0? 25yL，浓度为lOpmol/yL的SVCV-P-F0? 5yL，浓度为lOpmol/yL的SVCV-P-RO. 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0173] 扩增条件均为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50 次循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的SVCVPCR产物。
[0174] 按照实施例3步骤1中1. 2的焦磷酸测序的方法，分别以SVCV-S为测序引物对 样品1-40的SVCVPCR产物进行测序。结果显示（表2)，样品4、10、12、15、21、23和39的 SVCVPCR产物中均含有SVCV指纹序列，其余的PCR产物均不含SVCV指纹序列，表明样品 4、10、12、15、21、23