R2放回收集管中；注 意：配制70%乙醇时使用RNase-free ddH20,如果滤液体积有所损失，相应减少70%乙醇用 量；将溶液和沉淀转移至吸附柱CR2时，体积大于吸附柱容量，可以分两次完成； (10) 向吸附柱〇?2中加入350 4 1去蛋白液咖1，12,000印111(~13,400\8)离心30~60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中； (11) DNase I工作液的配制：取10 yl DNase I储存液放入新的RNase-free离心管 中，加入70 y 1 RDD溶液，轻柔混匀；（12)向吸附柱CR2中央加入80 y 1的DNase I工 作液，室温放置15分钟； (13) 向吸附柱CR2 中加入350 yl 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400Xg)离心 30~60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中； (14) 向吸附柱CR2中加入500 y 1漂洗液RW (使用前先检查是否已加入乙醇)，室温 静置2分钟，12, 000 rpm(~13, 400Xg)离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2 放回收集管中； (15) 重复步骤14 ; (16) 12, 000 rpm(~13, 400Xg)离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CR2置于室温放置数 分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗 液去除，离心后将吸附柱CR2在室温放置片刻，以充分晾干；如果有漂洗液残留，可能会影 响后续的RT等实验； (17) 将吸附柱CR2转入一个新的RNase-free离心管中，加入30~50 y 1 RNase-free ddH20室温放置2分钟，12, 000 rpm (~13, 400 X g)离心2分钟，得到RNA溶液；注意：洗脱缓 冲液体积不应少于30 y 1，体积过小影响回收效率。RNA溶液于-70°C保存。
[0021] 实施例3逆转录合成mRNA的cDNA第一链 (1) 在微量离心管内配制下列反应液，总量为20 yl:模板RNA溶液1 yg， 5XReverse Transcriptase Buffer 4 y1，dNTP Mixture (10 mM each) 2 y1，RNase Inhibitor 20 U，01igo(dT)18 Primer 50 pmol，AMV Reverse Transcriptase 10 U，加 RNase Free Water 至 20 y1 ; (2) 轻轻吸打混匀； (3) 室温放置10分钟后移入42°C恒温槽中； (4) 42°C保温1小时； (5) 在冰水中冷却2分钟。
[0022] 实施例4荧光定量PCR (1) 按下列组份配制PCR反应液(冰上进行):SYBR Premix Ex RNaseH Plus, 2X) 12. 5 y 1 ,Forward Primer (lOuDl yl, Reverse Primer (10 yM)l yl,cDNA 模板 2 yl，dH20 8.5 yl ; (2) 反应条件（Roche Cycler 480): a?变性：95°C 30 s ;1 cycle ; b. PCR :分析模式：定量分析；95°C 5 s ;60°C 30 s ;40 cycles ; c?融解：分析模式：融解曲线；93°C 5 s ;60°C 1 min ;1 cycle。
[0023] 实施例5 AhR表达水平与冠心病易感性和进展程度的关联分析 将所有生理生化指标包括身体质量指数（BMI)、肌酐酸（CK)、肌酸激酶（CK-MB)、葡 萄糖（Glu)、葡萄糖2小时（Glu2h)、脂蛋白A (Lpa)、血尿素氮（BUN)、血肌酐（Scr)、尿酸 (SUA)、胆固醇（Chol)、甘油三酯（TG)、高密度脂蛋白（HDL)、低密度脂蛋白（LDL)、载脂蛋白 A1 (ApoAl)、载脂蛋白B (ApoB)、肌红蛋白（MYO)、肌钙蛋白（Tnl-hs)、脑钠肽（BNP)、AhR进 行冠心病组与对照组、不同性别组、不同年龄组、冠心病亚组之间、对照组亚组之间进行统 计学分析。所有数据均采用^ ± s表示，两样本均数间比较采用学生（检验（student's t test);冠心病组与对照组之间病史的比较采用卡方检验；相关性分析用logistic回归 分析。用统计软件SPSS 20. 0进行统计学分析，当0直（尸value)〈 0. 05时认为存在显著 差异。血清中AhR与冠心病及其风险因素的相关性用多元逻辑回归模型进行分析，并通过 R0C曲线等统计学方法与目前常见临床生化标志物进行比较和评估各AhR对冠心病的识别 能力及诊断价值。
[0024] 血清AhR基因水平诊断冠心病的R0C曲线如图3所示。结果表明，随机选取53例 对照组和57例冠心病患者检测血清AhR的相对表达量，与对照组比较，冠心病组显著增高 了约2. 197倍，且不同类型冠心病组之间也有明显差异。
【主权项】
1. 一种检测冠心病的血清学生物标记物AhR，其特征在于：该生物标记物AhR所分离 出的DNA分子包括：编码具有芳香烃受体活性的多肽的核苷酸序列，其基因表达如SEQ ID NO. 4 ;所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO. 5。2. 根据权利要求1所述的血清学分子生物标记物AhR的用途，其特征在于：用于制备 判断冠心病发生的生物标志物试剂，包括制备用于筛查冠心病或辅助冠心病病理鉴定、临 床诊断、分子分型和生化检验的试剂、试剂盒。3. 根据权利要求2所述的血清学分子生物标记物AhR的用途，其特征在于：所述试剂 盒包括引物系统、引物探针系统； 所述引物系统由AhR的cDNA扩增引物和锚定引物组成； 所述引物探针系统由AhR的cDNA扩增引物和探针组成。4. 根据权利要求3所述的检测冠心病的血清学生物标志物的用途，其特征在于：所述 试剂盒检测该标志物的技术为荧光定量PCR技术或芯片法。5. 根据权利要求3所述的检测冠心病的血清学生物标志物的用途，其特征在于：所述 AhR的cDNA扩增引物为： 上游引物，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 :5' -AITGTGCCGAGTCCCATATC-3' ； 下游引物，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 :5' -AAGCAGGCGTGCATTAGACT-3'。6. 据权利要求3所述的检测冠心病的血清学生物标志物的用途，其特征在于：所述AhR 的探针由以下核苷酸序列组成：（6-FAM) AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA(MGB)。7. 根据权利要求4所述的检测冠心病的血清学生物标志物的用途，其特征在于：所述 荧光定量PCR技术为DNA染料法或TaqMan探针法。8. 根据权利要求5所述的检测冠心病的血清学生物标志物的用途，其特征在于：在荧 光定量PCR检测方法中，使用特异性基因的AhR作为靶分子，其cDNA扩增引物为： 上游引物，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 :5' -AITGTGCCGAGTCCCATATC-3' ； 下游引物，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 :5' -AAGCAGGCGTGCATTAGACT-3' ； 其探针为核苷酸序列如SEQ ID NO. 3 : (6-FAM) AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA(MGB)〇
【专利摘要】本发明公开了一种用于心脏病诊断和分型的超敏分子标记物及其应用。该生物标志物为AhR，可制备用于筛查冠心病或辅助冠心病病理鉴定、亚型鉴别和临床诊断的试剂、试剂盒、芯片等相关工具、产品。本发明的生物标记物AhR基因与冠心病发生发展密切相关，利用该AhR基因作为预测冠心病发生和判断冠心病发展程度的生物标志物，与目前常规的病理分型诊断冠心病发病和预后相比，可以更加个体化、准确、灵敏地预测和鉴别冠心病的早期发病情况、恶性程度及病理亚型。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105132565
【申请号】CN201510594921
【发明人】雷桅, 黄石安, 丁元林, 税晓容, 何原, 陈灿
【申请人】雷桅
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月18日