应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，A ACT法进行相对定量。
[0121] 3. 4统计学方法
[0122] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05 时具有统计学意义。
[0123] 4、Western 检测
[0124] 具体步骤同实施例2。
[0125] 2、结果
[0126] 如图3所示，与转染pcDNA3. 1空载体的细胞相比，转染pcDNA3. 1-SLC5A8的细 胞中SLC5A8的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义（P〈0. 05);如图4所示，与转染 pcDNA3. 1空载体的细胞相比，转染pcDNA3. 1-SLC5A8的细胞中SLC5A8的蛋白水平显著上 调，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0127] 实施例4刺激条件下0A成纤维样滑膜细胞增殖实验
[0128] 1、刺激条件下0A成纤维样滑膜细胞增殖实验
[0129] 1. 1 步骤
[0130] 将0A成纤维样滑膜细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔2X103Cells/孔/200 y 1， 37°C、5% C02培养箱孵育24小时后，加入滑膜液中（1 :5稀释），继续孵育24小时，之后分 别在所需检测的培养孔内每孔加入10 y 1 CK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育lh，测定 450nm处各孔吸光度值（0D值）。
[0131] 1.2统计学方法
[0132] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05 时具有统计学意义。
[0133] 1.3 结果
[0134] 结果如表1所示，与不加滑膜液刺激的对照组相比，加滑膜液刺激的FLS增殖明显 加快，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0135] 表1FLS细胞0D值
[0136]
[0137] 实施例5 SLC5A8基因过表达对刺激条件下0A成纤维样滑膜细胞增殖的影响
[0138] 1、步骤
[0139] 以2X 105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，按照实施例3的方法 进行细胞转染，每个实验组设计三复孔，每孔1〇〇 y 1，放置于37°C、5% 0)2培养箱中孵育， 转染24h后，加入滑膜液（1 :5稀释），继续孵育24小时，之后分别在所需检测的培养孔内 每孔加入10 y 1 CK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育lh，测定450nm处各孔吸光度值（0D 值）。
[0140] 2、统计学方法
[0141] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，SLC5A8基因过表达组与对照组之间的差异 采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0142] 3、结果
[0143] 结果如表2显示，与转染pcDNA3. 1空载体的细胞相比，转染pcDNA3. 1-SLC5A8抑 制了滑膜液刺激下的细胞增殖，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0144] 表2FLS细胞0D值
[0145]
[0146] 实施例6 SLC5A8基因过表达对0A成纤维样滑膜细胞增殖的影响
[0147] 1、步骤
[0148] 以2X 105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，按照实施例3的方法 进行细胞转染，每个实验组设计三复孔，每孔1〇〇 y 1，放置于37°C、5% 0)2培养箱中孵育， 转染48h之后分别在所需检测的培养孔内每孔加入10 y 1 CK-8溶液，在细胞培养箱内继续 孵育lh，测定450nm处各孔吸光度值（0D值）。
[0149] 2、统计学方法
[0150] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，SLC5A8基因过表达组与对照组之间的差异 采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0151] 3、结果
[0152] 结果如表3显示，与转染pcDNA3. 1空载体的细胞相比，转染pcDNA3. 1-SLC5A8细 胞增殖明显减慢，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0153] 表3 FLS细胞0D值
[0154]
[0155] 上述实施例的ii明只是用于理解本k明的方法及其核心 1思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测SLC5A8基因表达的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量 PCR、免疫检测、原位杂交芯片或高通量测序平台检测SLC5A8基因表达以诊断骨关节炎的 产品。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断骨关节炎的产品至少 包括一对特异扩增SLC5A8基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包 括一对特异扩增SLC5A8基因的引物；所述用免疫检测诊断骨关节炎的产品包括：与SLC5A8 蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨关节炎的产品包括：与SLC5A8基因的核酸 序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨关节炎的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白 芯片包括与SLC5A8蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与SLC5A8基因的核酸序列杂交 的探针。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品 至少包括的一对特异扩增SLC5A8基因的引物如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。5. -种诊断骨关节炎的工具，其特征在于，所述工具包括检测SLC5A8基因表达的试 剂；所述试剂包括检测SLC5A8基因mRNA的引物和/或探针、检测SLC5A8蛋白的抗体。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述检测SLC5A8基因mRNA的引物包括 SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的引物对。 7. SLC5A8基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进SLC5A8基因表达的试剂、促进 SLC5A8基因表达产物稳定性的试剂、促进SLC5A8基因表达产物活性的试剂、促进SLC5A8基 因表达产物功能的试剂。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，促进SLC5A8基因表达的试剂包括含有 SLC5A8基因的试剂、携带SLC5A8基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有SLC5A8蛋白质 的试剂。10. -种用于治疗骨关节炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括7-9中任 一项所述的促进剂。
【专利摘要】本发明公开了一种用于骨关节炎早期诊断的分子标志物-SLC5A8基因及其表达产物。本发明利用基因芯片和蛋白免疫方法证明在骨关节炎患者的滑膜组织中SLC5A8基因的mRNA表达水平和蛋白质表达水平显著低于正常滑膜组织。根据SLC5A8基因与骨关节炎的相关性，本发明公开了一种可用于诊断骨关节炎的试剂盒，该试剂盒可以测定SLC5A8基因的表达水平，由于该试剂盒可以在骨关节的早期即可诊断，所以在临床上具有广泛的应用前景。
【IPC分类】A61P19/02, A61K48/00, C12N15/11, C12Q1/68, G01N33/68, A61K38/17, C07K16/18
【公开号】CN105132574
【申请号】CN201510627048
【发明人】杨承刚, 任静
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月28日