具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗涤剂组合物的制作方法
【专利说明】具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗藻剂组 合物
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在 此。 发明领域
[0003] 本发明设及枯草杆菌蛋白酶在液体自动餐具清洗（ADW)洗涂剂中的稳定性。 阳004] 背景 阳0化]通常用一定含量的助洗剂配制液体自动餐具清洗（ADW)洗涂剂。该配制品可W包 括强馨合助洗剂（例如，含憐助洗剂，如憐酸盐和麟酸盐），并且它还可W包括其他助洗剂 (例如，弱助洗剂或沉淀助洗剂，如碳酸钢、碳酸氨钢和巧樣酸钢）。典型地，不用任何阴离 子型表面活性剂配制液体ADW洗涂剂，但是它们可含有或可不含非离子型表面活性剂。 [0006] 当配制一种液体餐具清洗（ADW)洗涂剂时，令人希望的是包括一种枯草杆菌蛋白 酶类型的蛋白酶，W便改善蛋白质污物的去除。然而，枯草杆菌蛋白酶在洗涂剂中的储存稳 定性存在着问题。 阳007] WO94/29428披露了包含酶和酶稳定系统的液体ADW洗涂剂，运些洗涂剂不含含 憐助洗剂。WO94/04651和WO2009/118375披露了包含蛋白酶和作为可逆蛋白酶抑制剂的 肤醒的液体洗涂剂。 阳00引概述
[0009] 诸位发明人已经发现，将一种强馨合助洗剂渗入一种液体ADW洗涂剂中趋向于使 得任何存在的枯草杆菌蛋白酶不稳定，但是渗入一种肤醒对于枯草杆菌蛋白酶在包含一种 强馨合助洗剂的液体ADW洗涂剂中的稳定特别有效。
[0010] 因此，本发明提供了一种液体（餐具清洗洗涂剂）组合物，包括：
[0011] a) -种强馨合助洗剂，
[001引b) -种枯草杆菌蛋白酶，W及
[0013] C)-种枯草杆菌蛋白酶抑制剂，该抑制剂是一种肤醒或其亚硫酸氨盐加合物或一 种肤甲基酬，其中该甲基可任选地被面素取代，并且其中该肤可任选地具有一个N端保护 基团；
[0014] 其中该组合物实质上不含阴离子型表面活性剂。
[0015] 本发明的其他方面和实施例在说明书和实例下是显而易见的。
[0016] 详细说明
[0017] 枯草杆菌蛋白酶
[0018] 在本发明的上下文中，枯草杆菌蛋白酶家族巧C3.4.21.62)应理解为如下文献 所述：西仁（Siezen)等人，蛋白质工程（Protein化即g. )4(1991)719-737 ;和西仁等人，蛋 白质科学（ProteinScience) 6 (1997) 501-523。如文中所描述的，枯草杆菌蛋白酶家族可W 划分为3个亚组，即I-SU"真正的"枯草杆菌蛋白酶）、I-S2(高碱性蛋白酶）W及细胞内 枯草杆困蛋白酶。
[0019] 枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽抱杆菌的那些，如枯草杆菌蛋白酶lentus、迟 缓芽抱杆菌、枯草杆菌蛋白酶Novo、嘉：t伯枯草杆菌蛋白酶（subtilisinCarlsberg)、地 衣芽抱杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147W及枯草杆 菌蛋白酶168(描述于WO89/06279中）W及蛋白酶PD138(W0 93/18140)。另外的实例 描述于WO98/020115、WO01/44452、WO01/58275、WO01/58276、WO03/006602W及WO 04/099401 中。
[0020] 有用的变体的实例描述于WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116W及WO 98/34946中，尤其是在一个或多个W下位置中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、 76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、 170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252W及 274,使用 BPN'编号。更优选地，运些枯草杆菌酶变体可W包括W下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、 *360、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,RS103A、V104I,Y,N、 S106A、G118V，R、H120D，N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、 V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN' 编号）。
[0021] 可商购的枯草杆菌蛋白酶的实例包括Kannase?、Everlase?、Primase?、 Duralase?、Esperase?、Alcalase?、Durazym?、Savinase?、Ovozyme?、Liquanase?、 Coronase?、F*olarzyme?、？5^"日36抓^及Clear-LensTMpro;Blaze? (诺维信公司（Novozymes A/S))。其他可商购的蛋白酶包括Ronozyme?P;ro、Maxatase?、Maxacal?、Maxapem?、 Opticle曰n?、Proper曰se?、Pur曰feet?、Pur曰feetOx?、PursfsctPrime?、Excell曰se?、 FN2?、FN3?W及FN4?(可从杜邦公司值upont)获得）。
[0022] 在本发明的一个实施例中，该枯草杆菌蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶309或枯草杆菌 蛋白酶BPN'、或任何运些的变体。优选地，该枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO: 1 或SEQIDN0:4的氨基酸序列具有至少70%的序列一致性，优选地至少75%，更优选地至 少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90 %，更优选地至少95 %、96%、97 %、98%、 99%，并且最优选地100%的序列一致性。在一个实施例中，该枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序 列是沈QIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3 或沈QIDN0:4。
[0023] 在一个实施例中，引入SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的氨基酸取 代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个 或10个；或多达5个，例如1个、2个、3个、4个或5个。运些氨基酸变化可W具有微小性 质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个 氨基酸的小缺失；小的氨基-或簇基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25 个残基的小接头肤；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段 (tract)、抗原表位或结合结构域。
[0024] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸及组氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酷胺和天冬酷胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、异亮氨酸及鄉氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘 氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸）。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本 领域已知的并且例如由H.诺伊拉特化化urath)和R.L.希尔巧.L.Hill)，1979,在蛋白 质（TheProteins),学术出版社，纽约中描述。常见的取代是Ala/Se;r、Val/Ile、Asp/Glu、 Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/ Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/GluW及Asp/Gly。
[0025]可W根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变（坎宁汉 (Cunnin曲am)和威尔斯（Wells) ,1989,科学（Science) 244:1081-1085)来鉴定多肤中的必 需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得 突变分子的枯草杆菌蛋白酶活性W鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，希尔顿 化ilton)等人，1996,生物化学杂志（J.Biol.Chem.) 271:4699-4708。也可W结合假定接触 位点氨基酸的突变，通过如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记等技术进行测定，来 对结构进行物理学分析，从而确定枯草杆菌蛋白酶的活性位点或其他生物学相互作用。参 见，例如，德弗斯（deVos)等人，1992,科学（Science) 255:306-312 ;史密斯（Smith)等人， 1992,分子生物学杂志（J.Mol.Biol. )224:899-904;乌乐达维尔（Wlodaver)等人，1992,欧 洲生化学会联合会快报（阳BSLett. )309:59-64。还可W从与相关多肤的比对来推断鉴定 必需氨基酸。
[00%] 可W做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组 的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森巧ei化aar-Olson) 和萨奥尔（Sauer) ,1988,科学（Science) 241:53-57 ;博维度owie)和萨奥尔，1989,美国国 家科学院院刊（Proc.化tl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156 ;W0 95/17413;或WO95/22625所 披露的那些。可W使用的其他方法包括易错PCR、隧菌体展示（例如，洛曼化owman)等人， 1991，生物化学度iochemistry) 30:10832-10837 ;美国专利号 5, 223, 409 ;W0 92/06204)W 及区域定向诱变（德比什尔值erbyshire)等人，1986,基因（Gene)46:145;内尔（Ner)等 人，1988,DNA7:127)。
[0027] 两个氨基酸序列之间的关联度通过参数"序列一致性"来描述。出于本发明 的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件灯he化ropean MolecularBiologyOpenSoftwareSuite),赖斯巧ice)等人，2000,遗传学趋势（Trends Genet.) 16:276-277)(优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔（Needle)程序中所实施的尼德 尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德尔曼）和Wunsch(翁施），1970,分 子生物学杂志（J.Mol.Biol. )48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所 使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分0. 5,W及邸L0SUM62度L0SUM62的EMBOSS版 本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作 百分比一致性，并且如下计算：
[002引（一致的残基X100)/(比对长度-比对中的空位总数）。
[0029] 任选的另外的酶
[0030] 除了枯草杆菌蛋白酶之外，该组合物能可任选地包括一种或多种另外的洗涂剂 酶，例如，5种、4种、3种、2种或1种另外的酶。运些另外的酶可W包括另外的蛋白酶、脂肪 酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳 聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶、漆酶、过氧化物酶和/或面代过氧化物酶。优选地，该 另外的酶是一种淀粉酶。
[0031]一般而言，一种或多种所选酶的性质应与选定的洗涂剂相容（即，最适抑，与其他 酶和非酶成分的相容性，等等），并且该一种或多种酶应W有效量存在。 阳〇扣]胎化酶巧巧质酶
[0033] 适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白 质工程化的突变体。实例包括来自嗜热真菌属（Thermomyces)的脂肪酶，例如来自如 在EP258068和EP305216中描述的疏棉状嗜热丝抱菌灯.Ianuginosus)(之前命名 为柔毛腐质霉）；来自腐质霉属的角质酶，例如在WO96/13580中描述的特异腐质霉； 一种假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌化alcaligenes)或类产碱假单胞菌 (P.pseudoalcaligenes)巧P218272)、洋葱假单胞菌（P.