] 在一个实施例中，该组合物的强助洗剂是=聚憐酸盐、乙二胺四乙酸、有机麟酸盐 或焦憐酸盐，尤其是如碱金属盐。
[0198] 在一个实施例中，该组合物的抑制剂和枯草杆菌蛋白酶W至少为1:1的摩尔比存 在。
[0199] 在一个实施例中，该组合物的枯草杆菌蛋白酶具有W下氨基酸序列，其与SEQID NO: 1具有至少80%序列一致性，优选地至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%或至少99%序列一致性。 阳200] 在一个实施例中，该组合物的枯草杆菌蛋白酶具有W下氨基酸序列，其与SEQID NO:4具有至少80%序列一致性，优选地至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98 %或至少99 %序列一致性。 阳201] 在又另一个实施例中，该组合物的枯草杆菌蛋白酶与SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 4 相比具有多达10个氨基酸变化，多达9个、多达8个、多达7个、多达6个、多达5个、多达 4个、多达4个、多达2个或多达1个氨基酸变化。
[0202] 在另一方面，本发明还提供了一种用于稳定一种液体（餐具清洗洗涂剂）组合物 中的枯草杆菌蛋白酶的方法，该方法包括混合上述液体组合物的运些成分。 阳203] 本发明还提供了W上组合物和方法用于改善枯草杆菌蛋白酶的储存稳定性，和/ 或包括在该液体组合物中的另一种另外的酶的储存稳定性的用途。该另外的酶描述于W上 段落"任选的另外的酶"中。该抑制剂降低了枯草杆菌蛋白酶活性，并且因此其他另外的酶 的蛋白水解降解降低，而储存稳定性得到改善。 阳204] 该液体组合物的抑可W在6. 0-11的范围内；尤其是在6. 0-10的范围内；尤其是 在6. 5-9. 5之间；或在7-9之间。抑可W在该组合物中直接测量或在水中的5%溶液中测 量。 悦化]实例 阳206]用作缓沖液和底物的化学品至少是试剂等级的商品。下文实例中所用的蛋白酶1、 蛋白酶2、蛋白酶3和蛋白酶4是枯草杆菌蛋白酶。蛋白酶1具有SEQIDNO: 1中所示的氨 基酸序列（枯草杆菌蛋白酶309)。蛋白酶2具有SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列（枯草 杆菌蛋白酶309变体）。蛋白酶3具有SEQIDNO:3中所示的氨基酸序列（枯草杆菌蛋白 酶309变体）。蛋白酶4具有SEQIDN0:4中所示的氨基酸序列（枯草杆菌蛋白酶BPN')。 阳2〇7] 实例1 阳208] 产生一种纯度>80%的肤醒亚硫酸氨盐加合物XB1-NH-CHR-CH0H-S03化，其中X = Cbz-Gly 也二 Ala ;R = -CHz-P(Qft)-OHD运是 Cbz-Gly-Ala-Tyr-H 的亚硫酸氨盐加合物。 阳209] 将上述肤醒亚硫酸氨盐加合物溶解于40%丙二醇中并添加水W制备24% w/w的 加合物溶液。制备=种不同的标准液体餐具清洗洗涂剂用于测试肤醒衍生的抑制剂，表示 强馨合助洗剂的=个不同的水平。
[0210] 表2.液体洗涂剂组合物。
[0211]
阳212]
[0213] 憐含量（P-含量）通过标准的理论方法进行计算，例如，对于具有依替麟酸（肥DP) 作为唯一含憐组分的洗涂剂B: 阳214]
[0215] 向洗涂剂基质中添加W下量的酶和抑制剂（上述肤醒亚硫酸氨盐加合物），将所 有样品标准化至100g的洗涂剂。将量W mg计的抑制剂作为纯的组分给出（从24%溶液中 添加）。W每克酶溶液〇.〇4g活性酶蛋白的浓度使用蛋白酶2和蛋白酶3。摩尔比表示抑 制剂相对于酶的摩尔比。
[0216] 表 3. 阳217]
[0218] 将运些洗涂剂在37°C的密闭玻璃容器中放置2周。使用标准酶分析方法测量蛋白 酶的残余活性（通过与储存在-18°C下的参照比较）（通过在40°C，pH= 8. 3下N，N-二甲 基酪蛋白的水解测量蛋白酶活性）。
[0219] 表4. 阳220]
阳221] 运些结果证实增加量的强馨合助洗剂趋向于使得枯草杆菌蛋白酶不稳定，并且该 肤醒亚硫酸氨盐加合物特别有效地稳定在包括含憐助洗剂盐的液体配制品中的枯草杆菌 蛋白酶。 悦巧 实例2 阳22引产生不同的肤醒，所有纯度都>80%。在使用之前，将运些肤醒溶解于DMSO中至lOmg/ml的浓度。
[0224] 向来自实例1的洗涂剂A中添加W下量的酶和不同抑制剂（肤醒），将所有样品 标准化至100g的洗涂剂。将量Wmg计的抑制剂作为纯的组分给出（从lOmg/mL溶液中添 加）。使用S种枯草杆菌蛋白酶：蛋白酶1、蛋白酶2和蛋白酶4,均W每克酶溶液0. 04g活 性酶蛋白的浓度。 悦巧]表5. 阳226]
[0227] 将运些洗涂剂在37°C的密闭玻璃容器中放置2周。使用标准酶分析方法测量蛋白 酶的残余活性（通过与储存在-18°C下的参照比较）（通过在40°C，pH= 8. 3下N，N-二甲 基酪蛋白的水解测量蛋白酶活性）。 阳22引表6. 阳229]
肥30] 运些结果证实肤醒有效地稳定在包括一种强馨合助洗剂的液体配制品中的枯草 杆园蛋白酶D
【主权项】
1. 一种液体餐具清洗洗涤剂组合物，包括： a) -种强螯合助洗剂， b) -种枯草杆菌蛋白酶，以及 c) 一种枯草杆菌蛋白酶抑制剂，该抑制剂是一种肽醛或其亚硫酸氢盐加合物或一种肽 甲基酮，其中该甲基可任选地被卤素取代，并且其中该肽可任选地具有一个N端保护基团； 其中该组合物实质上不含阴离子型表面活性剂。2. 如前述权利要求所述的组合物，其具有按重量计低于5%的含量的非离子型表面活 性剂。3. 如任一前述权利要求所述的组合物，其包括按重量计高于0. 1 %的量的强螯合助洗 剂。4. 如任一前述权利要求所述的组合物，其中该强螯合助洗剂是一种含磷助洗剂。5. 如前述权利要求所述的组合物，其包括对应于按该组合物的重量计至少0. 1 %，尤 其是按重量计1 %以上、2%以上、3%以上、4%以上或5%以上的磷含量的量的含磷助洗 剂。6. 如任一前述权利要求所述的组合物，其进一步包括一种另外的洗涤剂酶；优选一种 淀粉酶。7. 如任一前述权利要求所述的组合物，其中该抑制剂是一种具有式P-(A) y-L-(B) X-B°-R*的醛或酮或这种醛的亚硫酸氢盐加合物，其中： a) R* 是 H (氢）、CH3、CX3、0?2或 CH 2X ; b) X是卤素原子； 〇)8°是具有式-NH-CH(R)-C ( = 0)-的L-或D-构型的单一氨基酸残基； d) x 是 1、2 或 3 ; e) Bx独立地是各自经由其C端连接到下一个B或B °上的单一氨基酸残基； f) L 不存在或独立地是具有式-C( = 0)-、-C( = 0)-C( = 0)-、-C( = S)-、-C(= S)-C( = S)-或-C( = S)-C( = 0)-的连接基团； g) A不存在（如果L不存在）或独立地是经由氨基酸的N端连接到L上的单一氨基酸 残基； h) P选自下组，该组由以下各项组成：氢或（如果L不存在）一种N端保护基团； i) y 是 〇、1 或 2， j) R独立地选自下组，该组由以下各项组成：任选地被一个或多个相同或不同的取代 基R'取代的C16烷基、C 6 i。芳基或C 7 i。芳烷基； k) R'独立地选自下组，该组由以下各项组成：卤素、-011、-01?"、-311、-31?"、-順 2、-順1?"、-NR" 2、-C02H、-C0NH2、-C0NHR"、-C0NR" 2、-NHC ( = N) NH2;并且 l) R"是一个C16烷基。 m) x可以是1、2或3。8. 如任一前述权利要求所述的组合物，其中该抑制剂是一种具有式P-B "-B1-Bid-H的醛 或一种具有式P-B 2-B1-N(H) -CHr-CHOH-SO3M的加合物，其中 a) H是氢； 幻8°是具有式-NH-CH(R)-C ( = 0)-的L-或D-构型的单一氨基酸残基； OB1和B 2独立地是单一氨基酸残基； d) R独立地选自下组，该组由以下各项组成：任选地被一个或多个相同或不同的取代 基R'取代的C16烷基、C 6 i。芳基或C 7 i。芳烷基； e) R'独立地选自下组，该组由以下各项组成：卤素、-011、-01?"、-311、-31?"、-順 2、-順1?"、-NR" 2、-C02H、-C0NH2、-CONHR"、-C0NR" 2、-NHC ( = N) NH2; f) R"是一个C16烷基；并且 g) P是一个N端保护基团。9. 如权利要求7或8所述的组合物，其中R是这样的，使得B ° = -NH-CH (R) -C ( = 0)-是 Phe、Tyr 或 Leu010. 如权利要求7-9中任一项所述的组合物，其中B 1是Ala、Gly或Val。11. 如权利要求7-10中任一项所述的组合物，其中B 2是Arg、Phe、Tyr或Trp。12. 如权利要求7-11中任一项所述的组合物，其中x = 2, L不存在，A不存在，并且P 是对甲氧羰基（Moc)或节氧羰基（Cbz)。13. 如任一前述权利要求所述的组合物，其中该抑制剂是Cbz-Arg-Ala-Tyr-H、 Ac-Gly-Ala-Tyr-H、 Cbz-Gly-Ala-Tyr-H、 Cbz-Gly-Ala-Tyr_CF3、 Cbz-Gly-Ala-Leu-H、 Cbz_Val_Ala_Leu _H、 Cbz_Val_Ala_Leu_CF3、 Moc_Val_Ala_Leu_CF3、 Cbz-Gly-Ala-Phe-H、 Cbz-Gly-Ala-Phe-CF3' Cbz-Gly-Ala-Val-H、 Cbz-Gly-Gly-Tyr-H、 Cbz-Gly-Gly-Phe-H、Cbz-Arg-Val-Tyr-H、Cbz-Leu-Val-Tyr-H、Ac-Leu-Gly-Ala-Tyr-H、 Ac-Phe-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Tyr-Gly-AIa-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-AIa-Leu-H、 Ac-Phe-Gly-Ala-Phe-H、Ac-Phe-Gly-Val-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Met-H、 Ac-Trp-Leu-Val-Tyr-H、 MeO-CO-Val-Ala-Leu-H、 MeNCO-Val-Ala-Leu-H、 MeO-⑶-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeO-⑶-Phe-Gly-Ala-Phe-H、MeS0 2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、 MeS02-Val-Ala-Leu-H、PhCH 2O-P(OH) (O)-Val-Ala-Leu-H、EtS02-Phe-Gly-Ala-Leu-H、 PhCH 2S02-Val_Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH) (O)-Leu-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH) (O)-Phe-Ala-Leu-H、或 MeO-P(OH) (O)-Leu-Gly-Ala-Leu-H 或任何这些的亚硫酸氢盐加合 物，其中Cbz是苄氧羰基并且Moc是甲氧羰基。14. 如任一前述权利要求所述的组合物，其中该抑制剂是Cbz-Gly-Ala-Tyr-H或 Moc-Val-Ala-Leu-H、或其亚硫酸氢盐加合物，其中Cbz是节氧羰基并且Moc是甲氧羰基。15. 如任一前述权利要求所述的组合物，其中该强助洗剂是三聚磷酸盐、乙二胺四乙 酸、有机膦酸盐或焦磷酸盐，尤其是如碱金属盐。16. 如任一前述权利要求所述的组合物，其中该抑制剂和该枯草杆菌蛋白酶以至少为 1:1的摩尔比存在。17. 如任一前述权利要求所述的组合物，其中该枯草杆菌蛋白酶具有以下氨基酸序列， 其与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 4具有至少80%序列一致性，或其与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:4相比具有多达10个氨基酸变化。
【专利摘要】通过肽醛、其亚硫酸氢盐加合物或肽甲基酮稳定枯草杆菌蛋白酶在包含强螯合助洗剂的液体ADW洗涤剂中特别有效。
【IPC分类】C07K5/04, C11D3/386, C07K5/02
【公开号】CN105164147
【申请号】CN201480022673
【发明人】H·P·尼尔森, L·M·米克尔森, M·内尔比, J·江
【申请人】诺维信公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2014年4月23日
【公告号】WO2014173980A2, WO2014173980A3