一种用于检测PRRSV经典疫苗株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测技术领域，具体说是一种用于检测猪 繁殖与呼吸综合征经典疫苗株病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，本发明还包括该 试剂盒的使用方法。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS) 自二十世纪八十年代末期开始流行，1992年国际兽医局正式命名，主要感染猪，尤其是母 猪，该病严重影响其生殖功能，临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难，仔 猪死亡率高、感染猪出现免疫抑制等现象，因在发病过程中出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故 又称为蓝耳病。
[0003]PRRS其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveand respiratorysyndromevirus，PRRSV)，自1996年我国首次分离到美洲型CH_la株以来， 我国流行的PRRSV毒株均属于美洲型，并将CH-la作为经典疫苗毒株。据统计，PRRS每年 给美国养猪业造成的直接经济损失为5. 6亿美元，而美国用于该病的防控研究经费高达6 亿美元。难怪，国内外许多知名专家和学者将该病与猪瘟称为对养猪业最具危害的两大杀 手。国际兽疫局（0ΙΕ)将其列为需要通报的B类传染病，我国亦将其列为二类传染病。值 得重视的是，自2006年5月份以来，我国南方大部分地区猪群出现了以高热、厌食或不食、 眼结膜炎、咳嗽、气喘等呼吸道症状、后驱无力以致无法站立或摇摆等神经症状及高死亡率 为主要临床特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征，该病已给养猪业造成了巨大的经济损 失。经基因组序列分析得知，高致病性PRRSV为美洲型、且Nsp2 (非结构蛋白2)基因序列 缺失90nt(核苷酸）的PRRSV变异毒株。目前，国内外就PRRSV的检测方法而言，已有复合 式RT-PCR方法，普通RT-PCR方法，荧光定量RT-PCR方法，但是上述方法都是通用型的，只 能检测是否PRRSV感染，无法区分检测到的毒株是疫苗株，还是田间变异株感染引起，导致 接种疫苗存在盲目性，进而加大了预防和监测PRRS的难度。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服目前国内市面缺乏用于检测PRRSV经典疫苗株 的技术手段的难题，提供一种能够快速、敏感、准确以及低成本的用于检测猪繁殖与呼吸综 合征病毒经典疫苗株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用 方法，本试剂盒及使用方法还适用于检测低微含量的猪繁殖与呼吸综合征经典疫苗株病 毒。
[0005] 为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：
[0006] 一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征经典疫苗株病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR 试剂盒，包括OneSt印RT-PCRbuffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQIDNO: 1 和SEQIDN0:2的引物及SEQIDN0:3的探针引物的混合物。
[0007] 所述序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:2的引物混合物包括：
[0008]SEQIDN0:1 :上游引物TCCTGCACCGCGTAGAACTGTGT;
[0009]SEQIDNO:2 :下游引物AACGCAGACAAATCTAGAGGCTCGTC。
[0010] 探针引物序列为：
[0011]SEQIDN0:3 :CCCGACCGATGACGCCCTTGAGTG。
[0012] 所述探针引物的5'端标记物为FAM报告荧光基团、3'端标记物为TAMRA淬灭荧光 基团。
[0013]SEQIDN0:1 至SEQIDN0:2 的由 5'端向 3'端延长的序列：SEQIDN0:4(156bp):
[0014]tcctgcaccgcgtagaactgtgtcccgaccgatgacgcccttgagtgagccaatttttgtgtctgca ccgcgacacaaatttcagcaggtggaagaagcgaatccggcggcaacaacgctgacgtaccaggacgagcctcta gatttgtctgcgtt〇
[0015] 所述阴性对照为无RNA/DNA酶水。
[0016] 所述阳性对照为含有PRRSV经典疫苗株基因序列的阳性质粒pGM-156,其构建方 式如下：
[0017]a.PRRSV经典疫苗株基因组RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit说明书进行操 作。以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成cDNA。以SEQIDNO: 1及SEQIDNO: 2作为 引物扩增，反应条件为94°C预变性5min;94°C变性50s，56°C退火40s，72°C延伸50s，共30 个循环；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0018]b.PCR产物的克隆及序列分析
[0019]PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-TEasy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板 上，37°C培养12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列 测定正确的质粒命名pGM-156,应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为 372ng/ul，计算出其拷贝数为1. 23xlOn (copies/ul，拷贝数/微升），本发明的试剂盒利用 1. 23xl07(C〇pies/ul)浓度的质粒作为阳性对照以及利用其倍比稀释后制作为标准曲线。
[0020] 本发明还提供了所述试剂盒用于检测猪繁殖与呼吸综合征经典疫苗株病毒时的 使用方法，包括以下步骤：
[0021] 配比反应体系如下：
[0022] a.OneStepRT-PCRbuffer: 12. 5 份；
[0023]b.弓丨物浓度均为lOpmol/μ1的三条引物混合液3份，其中156bp上游引物1份， 156bp下游引物1份，探针引物1份；
[0024]c.酶混合物1份；
[0025]d.无RNA/DNA酶水 5· 5 份；
[0026]e.提取样品的RNA模板3份；
[0027]f.阳性对照pGM-156阳性质粒3份；
[0028]g.阴性对照无DNA酶水3份。
[0029] 使用本试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR，扩增条件如下：
[0030] 42°C反转录 5min;94°C预变性 2min;94°C20s，退火温度 56°C30s，72°C20s，40 个循环。
[0031] 使用本试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR，根据扩增结果，判定标准为：
[0032] 在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复 检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可以依扩增得到的Ct值 根据标准曲线对样品进行准确定量。
[0033] 本发明弥补了PRRSV鉴别诊断上的薄弱环节，建立了特异检测疫苗株的实时定量 PRRSV核酸检测试剂盒。本发明在检测过程中将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成， 使得检测时间由原来的4-5小时缩短到现在的1-2小时，从而有利于快速检测。并且比普 通PCR的灵敏度高，对模板浓度要求较低，可用于检测低微含量的蓝耳病病毒；无需电泳就 可直观的反应检测结果，避免了溴化乙锭对人体健康的危害；同时本发明使用了探针法，只 有探针引物特异的结合到扩增的靶序列上时才会产生有效的结果，而且可以看到整个扩增 过程、扩增效率、溶解温度，利用已知起始拷贝数的标准品直接得到标准曲线，因此，只要获 得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，进行精确定量，具有 高度特异、敏感、简单、准确等特点。该方法有助于PRRSV经典疫苗株的防控和隐性带毒动 物的剔除，避免造成大范围的传染。本使用方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽 医站及大中小型养殖场等，具有较好的应用前景。
【附图说明】
[0034] 图1.为本发明制作的标准曲线。
[0035] 图2.为本发明样本检测图。
[0036] 图1中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述
[0038] 实施例1
[0039] 1、引物的设计和制备
[0040] 参照GenBank(基因库）查找十株毒株，经序列比对寻找每个序列上均保守的区 ±或，选取保守区域并设计一对扩增引物，一条探针引物，序列如下：
[0041] 扩增引物序列为：
[0042] SEQIDN0:1 :上游引物TCCTGCACCGCGTAGAACTGTGT;
[0043] SEQIDN0:2 :下游引物AACGCAGACAAATCTAGAGGCTCGTC。
[0044] 探针引物序列为：
[0045] SEQIDN0:3 :CCCGACCGATGACGCCCTTGAGTG。
[0046] 上述引物由大连宝生物工程有限公司合成并进行标记。
[0047] 阳性对照：本发明试剂盒的阳性对照是由中国农业科学院兰州兽医研究所构建并 保存。
[0048] 2、制作阳性对照及其对应标准曲线
[0049] 阳性对照为含有PRRSV经典疫苗株基因序列的阳性质粒pGM-156,其构建方式如 下：
[0050]a.PRRSV经典疫苗株基因组RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit说明书进行操 作。以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成CDNA。以SEQIDN0:1及SEQIDN0:2作为 引物扩增，反应条件为94°C预变性5min;94°C变性50s，56°C退火40s，72°C延伸50s，共30 个循环；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0051] b.PCR产物的克隆及序列分析
[0052]PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-TEasy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板 上，37°C培养12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列测定 正确的质粒命名PGM-156,应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为372ng/ ul，并计算出拷贝数为1. 23xlOn (copies/ul，拷贝数/微升），将其10倍倍比稀释后按照 标准曲线制作程序制作标准曲线，依标准曲线1. 23xl07(copies/ul)浓度的质粒作为阳性 对照。
[0053] 3、制备用于检测10头份的试剂盒
[0054] 本试剂盒由以下组分组成：
[0055]a.OneStepRT-PCRbuffer：125μ1 ；
[0056]b.引物浓度均为lOpmol/μ1的三条引物混合液30μ1，其中156bp上游引物 10μ1，156bp下游引物10μ1，探针引物10μ1;
[0057]c.酶混合物 10μ1;
[0058]d.无RNA/DNA酶水 100μ1;
[0059]e.阳性对照pGM-156阳性质粒30μ1〇
[0060] 4、用本发明试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征经典疫苗株病毒
[0061] (l)PCR总体系为25μ1。分别将本发明