>[0068] 将化学合成的Pb-CATH4W2mg/ml的浓度溶解在无菌超纯水中；用接种环挑取新 活化的微生物，然后均匀涂布在新的LB琼脂板上；将直径0. 5cm的圆形无菌滤纸片放在上 述琼脂板上，然后向纸片上滴加10μ1Pb-CATH4样品溶液；放入37°C恒溫培养箱中培养 12-2地；观察抑菌圈形成与否，将对化-CATH4敏感的菌株记录下来。
[0069] 2.Pb-CATH4 对敏感菌株最小抑菌浓度（MinimumInhibitoiyConcentration, MIC)的测定。
[0070] 该实验W无菌的LB液体培养基作阴性对照，观察有细菌生长孔的浓度与无细菌 生长的孔的浓度，取平均值即为最小抑菌浓度。
[0071] 挑取新活化的微生物，接种至无菌液体LB培养基，37°C恒溫振荡器中20化pm培 养10-1化至对数生长期；用紫外分光光度计测菌液600nm处的吸光值，吸光值为1时，浓 度大约为109c化/ml,将菌液用无菌液体LB培养基稀释至2X105c化/ml,冰上待用；用二倍 稀释法在96微孔板上用无菌LB培养基配制浓度梯度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、 25μg/ml、12. 5μg/ml、6. 25μg/ml、3. 13μg/ml、1. 56μg/ml、0. 78μg/ml、0. 39μg/ml、 0. 20μg/ml的Pb-CATH4样品溶液，每孔50μ1 ;每孔加入50μ1上述稀释菌液；在恒溫振荡 器中37°C，10化pm振荡培养10-1化；使用酶标仪测600皿吸光值或肉眼观察；上述实验重 复3次。
[007引表1Pb-CATH4的最小抑菌浓度（MIC)
[0073]
[0074]
[00巧]
[007引*MIC:最小抑菌浓度；ND:抑菌圈实验检测无抑菌活性；IS:临床分离菌株。W上结 果为Ξ次独立重复实验平均值。
[0077] 由表1可见，Pb-CATH4对测试所用微生物具有广谱的抗菌活性，其MIC值大都 在2. 68-10. 74μΜ之间，抗菌活性明显强于传统使用的抗生素氨节青霉素（MIC值大都在 12. 62 - 201. 9μΜ之间）。Pb-CATH4不仅对革兰氏阳性菌（G+)和革兰氏阴性菌（G)具有 抗菌活性，还对测试用的所有真菌都有抗菌活性，特别是对几种常见的临床分离的致病菌 株如肺克杆菌，铜绿假单胞菌，表皮葡萄球菌W及白色念珠菌等具有强的杀菌作用。其中， Pb-CATH4对频疾杆菌最为敏感，最小抑菌浓度仅为1. 34μM。
[0078] 3.Pb-CATH4的杀菌动力学检测。
[0079] 活化菌株：将大肠杆菌ATCC25922划线接种到LB固体培养基平板上，置于37°C培 养箱中倒置培养至单菌落长出。用接种环挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37°C振荡过 夜培养至对数生长期。用新鲜的LB液体培养基将菌液稀释至1X105C即/ml的浓度，备用。
[0080] 将Pb-CATH4或者美罗培南加入到稀释好的菌液中，使其终浓度为5倍MIC(阴性 对照用相应体积的灭菌双蒸水）。加入样品的菌液迅速放入37°C振荡培养箱中培养，分别 于Omin、10min、20min、30min、45min、60min、90min及 120min时取 10μ1 菌液用灭菌的LB 液体培养基稀释100倍，然后取lOOul稀释后的菌液涂LB固体培养基，37°C过夜培养，计算 菌落数。
[0081] 由附图可知，Pb-CATH4杀菌迅速，在10分钟内就能够杀死全部大肠杆菌 ATCC25922细胞；而阳性对照美罗培南作用相对较慢，需要90分钟才能全部杀死大肠杆菌 ATCC25922。美罗培南是人工合成的广谱碳青霉締类抗生素，通过抑制细菌细胞壁的合成而 产生抗菌作用。与美罗培南相比，Pb-CATH4迅速的杀菌能力表明其作用机制不可能是抑制 细菌细胞壁的合成，也不可能是抑制细菌细胞内核酸、蛋白质的合成或抑制细菌某些蛋白 酶的活性，因为运需要一定的作用时间才能导致细菌的死亡，从而可W看出化-CATH4具有 不同于传统抗生素的独特的杀菌机理，也正因为运点而不易引起菌体耐药性的产生，显示 了化-CATH4的良好的抗菌药用前景。
【主权项】
1. 一种源于緬甸癖的cathelicidin家族广谱抗微生物肽肽Pb-CATH4,其特征在于，所 述的cathelicidin家族广谱抗微生物肽Pb-CATH4是直链多肽，含有29个氨基酸残基，理 论等电点为12. 54,分子量是3492.llDa，其序列为：苏氨酸-精氨酸-丝氨酸-精氨酸-色 氨酸-精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-精氨 酸-苯丙氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-酪氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸-异亮氨 酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸。2. 按权利要求1所述cathelicidin家族广谱抗微生物肽肽Pb-CATH4的基因，其特征 在于，编码Pb-CATH4前体肽的基因由465个核苷酸组成，自5'端至3'端序列为： 1 ' ！?广、ry,llI?-U^ ^ 、?' ri?、、?、 、 61€aggt：g：g;t'Ga c.c:t：a：^：gat：ca a'tist'ttataa 'r2i^aee逸tlgcette'cg :cetget.:g:g_aa .get.:g'agc'G.ge 181 ggcaaaaccacgcaggggctgaagttcaccatcaaggagacggtgtgcccctccgcgcag SM.I t〇'accv.a：gt；g 'G：aatt：t〇'a^g： ga^gac.g：g'gg tx.g'c：'t；cGgga W.1 a〇'〇taa't：eta' ：ge€a'〇ca；aatct;taa't：gt〇Oagt：gt-ga^Eaeatt;gB^'C.a；a 361 gagct；g：ae'C：c： g：g;at：(jacs.a：g ：ae.g:tog€t：gg: .agaeg：a；ttc：s. taag:g.gga：g：c ,g:g.gac：g：ct't'：c： 421 g.c：0a'g；gagat：B.t：g：ga；.t.gga'g gg^o.t^gtgg.gat：aa.. 编码成熟肽Pb-CATH4的376位到462位的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列为：!!^1-Arg2-Ser3-Arg4-Trp5-Arg6-Arg7-Phe8-Ile9-Arg10-Glyn-Ala12-Gly13-Arg14-Phe15-Ala16-Arg17 -Arg18-Tyr19-Gly20-Trp21-Arg22-Ile23-Ala24-Leu25-Gly26-Leu27-Val28-Gly29〇3. 权利要求1所述的cathelicidin家族广谱抗微生物肽肽Pb-CATH4的制备方法，其 特征在于，根据基因编码的Pb-CATH4氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列；通过 HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于97% ;用基质辅助激光解析电离飞行时间质 谱测定其分子量；等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。4. 权利要求1所述cathelicidin家族广谱抗微生物肽肽Pb-CATH4,具有极强的广谱 抗微生物活性，作为制备抗病原微生物感染药物或化妆品、保健品、食品、饲料的添加剂。5. 权利要求2所述cathelicidin家族广谱抗微生物肽肽Pb-CATH4的基因，据其合成 的Pb-CATH4抗微生物肽具有很强的抗微生物活性，能够溶于灭菌超纯水，用于药理活性检 测。
【专利摘要】本发明属于生物医学技术领域，涉及一种缅甸蟒蛇的cathelicidin家族广谱高效抗微生物肽Pb-CATH4及其基因、制备方法和应用。Pb-CATH4是直链多肽，含有29个氨基酸残基，理论等电点为12.54，分子量是3492.11Da。Pb-CATH4的前体基因由465个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第376-462位核苷酸。Pb-CATH4富含碱性氨基酸，分子量小、结构简单，方便化学合成及基因工程制备。Pb-CATH4具有极强的广谱抗微生物活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均有活性，还具有独特的抗菌机理及不易产生耐药性等有益特点，应用前景广阔。
【IPC分类】A23K20/147, A61P31/10, C12N15/12, C07K14/46, A61K38/17, A61P31/04, A23L33/18
【公开号】CN105254736
【申请号】CN201510556201
【发明人】于海宁, 王义鹏, 蔡莎莎, 王慧
【申请人】大连理工大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月2日