>[0048] 如图2所示，为未使用消泡剂处理在滚瓶（2000ml)培养的PK-15细胞状态图（肉 眼观察）；如图3所示，为未使用消泡剂处理在滚瓶（2000ml)培养的PK-15细胞状态图（显 微镜观察）。从图2、图3中可得，将在方瓶中扩繁后的PK-15细胞消化分散后，分装至滚瓶 中培养，在操作过程中产生的泡沫未及时消除，粘附于瓶壁，导致细胞在泡沫附着位置大量 聚集，最终导致细胞大量聚集成团。
[0049] 如图4所示，为使用消泡剂（浓度：3μL/200血）处理后在滚瓶（2000ml)培养的 PK-15细胞状态图（肉眼观察）；如图5所示，为使用消泡剂（浓度：3μL/200mL)处理后在 滚瓶（2000ml)培养的PK-15细胞状态图（显微镜观察）。从图4、图5中可得，PK-15细胞 在滚瓶传代培养时加入消泡剂处理后，细胞生长状态良好，且能有效减少细胞聚团。
[0050] 表1所示，为在使用消泡剂和不使用消泡剂的情况下，ΡΚ-15细胞分别在2000ml和 15000ml滚瓶中的生长状况。
[0051] 表1.PK-15细胞在滚瓶中的生长状况
[0052]
[0053] 从表1中可W看出，本发明实施例在0. 5-3. 0μL/200mL的范围内进行试验，当消 泡剂浓度为0. 5-1μL/200mL时，细胞的生长状态欠佳，细胞出现团聚现象；当消泡剂浓度 为1. 5-3μL/200血时，细胞生长状态良好，无团聚现象。因此，确定1. 5-3μL/200血为消 泡剂的最佳浓度。消泡剂能有效消除细胞传代操作过程中产生的泡沫，但消泡剂为去污剂， 对细胞具有毒性。当消泡剂的浓度高时，毒性较大，容易导致细胞死亡；而浓度低时，虽然 毒性降低，但消泡效果较差，不能有效地在短时间内消除泡沫。研究表明，当消泡剂浓度为 1. 5-3. 0μL/200mL时，消泡效果佳，细胞团聚少，且生长状态良好，为最佳浓度。
[0054] 3、改良的PK-15细胞传代培养方法的应用 阳化5] 3. 2方法与操作步骤
[0056] 3. 2. 1PK-15 细胞的扩繁
[0057] 从液氮中取出冻存的PK-15细胞，于42°C水浴中快速解冻，100化pm离屯、5min，用 含lOwt%胎牛血清、Iwt%青链霉素的DMEM生长液悬浮，置37°C、5%C〇2的培养箱中，培养 至融合状态为100%的细胞单层，用含膜蛋白酶的消化液分散后分装扩大培养。
[(K)郎]3. 2. 2猪圆环病毒2型（JM株）的增殖
[0059] 将3. 2. 1中扩大培养的细胞用含膜蛋白酶的消化液分散后，分装至15000mL的滚 瓶中，添加培养液至1500ml，细胞浓度为IX104个/mU其中培养液含lOwt%胎牛血清和 Iwt%青链霉素；加入2μL/200mL消泡剂，同时设非处理对照组，分别按滚瓶内培养液体积 的5%接种猪圆环病毒2型病毒悬液，混匀后于37°C、6r/h滚瓶机中培养2地，弃去培养液， 用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃去液体，加%胎牛血清的DMEM培养液，继 续培养72h，冻融收获病毒液。按此方法重复3批。 W60] 3. 2. 3猪圆环病毒2型（JM株）的病毒滴度测定 阳06U 将3. 2. 1获取的单层ΡΚ-15细胞消化分散，用含lOwt%胎牛血清的DMEM培养液制 成浓度约为2X105个/ml的细胞悬液，按每孔200μ1加入到48孔细胞培养板。取3. 2. 2 中收获的病毒液，用DMEM培养液做10倍系列稀释至10 7,每个稀释度病毒液W每孔200μ1 接种，分别接种4孔至分装在48孔培养板中的ΡΚ-15细胞，非处理对照组执行相同的操作； 置37°C、5%C〇2的培养箱中培养2地，弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min 后，弃去液体，加%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养4她。 阳06引弃细胞维持液，用憐酸缓冲盐溶液（PBS，0.Olmol/L，抑值7. 4)洗涂3次，每次 2-3min，用 200μl80%冷丙酬固定30min，弃去固定液，再用PBS洗2次，每次5min，每孔加 入200μ1的PCV2多克隆抗体，其中PCV2多克隆抗体用PBS作1 : 200稀释，置37°C作用 lh，PBS洗涂5次，每次5min。最后每孔加入200μ1FITC标记的羊抗猪二抗，其中FITC标 记的羊抗猪二抗用PBS作1 : 100稀释，37°C作用比，PBS洗涂5次，每次5min。
[0063] 在倒置显微镜下观察结果，如果出现绿色巧光信号，判为PCV2阳性；否则判为阴 性。按Reed-Muench法计算其TCIDg。。 W64] 3. 2结果与讨论 阳0化]采用改良的PK-15细胞传代培养方法培养细胞后，增殖猪圆环病毒2型（JM株） 的病毒含量情况如表2所示。从表2可看出，经过消泡剂处理后，细胞增殖病毒的病毒含量 显著高于对照组，表明消泡剂处理后细胞均匀生长，有利于病毒增殖。
[0066] 表2猪圆环病毒2型（JM株）病毒含量
[0067]
[0068] 对本领域的技术人员来说，可根据W上描述的技术方案W及构思，做出其它各种 相应的改变W及形变，而所有的运些改变W及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围 之内。
【主权项】
1. 一种改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将ΡΚ-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积的 10%，ΡΚ-15细胞在培养液中的浓度为1-5Χ104个/mL，所述培养液含10wt%胎牛血清、 lwt%青链霉素； 2) 加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0. 5-3. 0μL/200mL，混匀后于37°C、6r/ h转瓶机中培养，至融合状态达到80%以上。2. 根据权利要求1所述的改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，所述消泡剂在 滚瓶中的浓度为1. 5-3. 0μL/200mL。3. 根据权利要求1所述的改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，所述步骤1) 中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮 中冻存的PK-15细胞复苏后，用含10wt%胎牛血清、lwt%青链霉素的DMEM生长液悬浮，置 于37°C、5% 0)2的培养箱中培养，形成100%融合状态的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液 分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。4. 根据权利要求3所述的改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，所述PK-15细 胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42°C水浴中快速解冻，然后lOOOrpm离心5min。5. 如权利要求1-4任一项所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在 于： 1) 取PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积的 10%，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5X104个/mL，所述培养液含10wt%胎牛血清、 lwt%青链霉素； 2) 加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0. 5-3. 0μL/200mL，按滚瓶内培养液体 积的5%接种猪圆环病毒2型病毒悬液，混匀后于37°C、6r/h转瓶机培养24h; 3) 弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃去液体，加含2wt%胎牛 血清的DMEM培养液，继续培养72h，冻融收获病毒液。6. 根据权利要求5所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于，所述消 泡剂在滚瓶中的浓度为1. 5-3. 0μL/200mL。7. 根据权利要求5所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于，所述步 骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将 在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含10wt%胎牛血清、lwt%青链霉素的DMEM生长液悬 浮，置于37°C、5% 0)2的培养箱中培养，形成100%融合状态的细胞单层，用含胰蛋白酶的 消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。8. 根据权利要求7所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于，所 述PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42°C水浴中快速解冻，然后lOOOrpm离心 5min〇
【专利摘要】本发明公开了一种改良的PK-15细胞传代培养方法，在PK-15细胞传代培养过程中，加入消泡剂，消泡剂能有效消除细胞传代操作过程中产生的泡沫，使细胞生长状态保持良好，且能有效减少细胞聚团。本发明还把所述改良的PK-15细胞传代培养方法用于猪圆环病毒2型的增殖，增殖后猪圆环病毒2型病毒含量高。
【IPC分类】C12N7/02, C12N7/00, C12N5/071
【公开号】CN105255818
【申请号】CN201510783971
【发明人】佘峥, 陈瑞爱, 黄红亮, 任常宝, 谢小雨
【申请人】肇庆大华农生物药品有限公司, 广东温氏大华农生物科技有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月13日