具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肤，及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 现代社会的高速发展带来了经济腾飞和生活便利，同时，也给人们带来了压力，当 人们长期处在高压力环境中，会出现记忆衰减或神经性损伤。此外，人类机体的自然老化、 大脑创伤W及大脑退行性疾病同样也会造成记忆退化。研究表明，记忆的下降或退化与大 脑海马区病变、神经递质减少W及突触病变等有关。此外，发生在中枢神经系统（Central nervoussystem,CN巧的氧化应激和炎症损伤会随着年龄的增加而增加，从而导致许多与 年龄相关的神经退行性疾病的产生，如阿尔茨海默病、帕金森病等疾病。其中，阿尔茨海默 病（Alzheimer'SDisease,AD)，又称老年痴呆症，W短期记忆障碍为主要临床表现的进行 性神经病变疾病，是影响中老年人生活质量的隐形杀手。因此，探索和研究具有预防、改善 或治疗与记忆相关疾病的功能物质成为了热点。
[0003] 美拉德反应（MaillardReaction,MR)是食品在热加工和胆藏过程中自然发生的 幾基和氨基之间的化学反应，赋予热加工食品W独特的风味。已有大量研究表明，美拉德反 应产物（MR巧可W提供令人愉悦的风味，而且也有文献报导其可W提升肤的抗氧化与抗炎 症作用，而抗氧化与抗炎症作用对记忆均具有一定的改善效果。因此，美拉德反应是一种潜 在提升改善记忆肤活性的手段之一。
[0004] 海洋鱼蛋白质资源丰富，是一种制备生物活性肤的优质蛋白原料。近年来，在利用 海洋鱼蛋白制备生物活性肤方面取得了一定的进展，例如利用海洋鱼制备具有降血压、抗 贫血、抗痛风W及补充胶原蛋白等活性的蛋白肤产品。 阳0化]申请号为201110167083X，名称为深海鱼为原料制备具有改善记忆的生物活性 肤的方法"的中国专利公开了W深海鱼类为主要原料开发生物活性肤的制备方法，通过采 用限制性酶解、超滤及离子交换树脂分离纯化获得得记忆改善肤；并通过小鼠实验表明该 肤具有明显的改善记忆功效。但该法工艺复杂，需要多步分离纯化，难于实现大规模生产。
[0006] 凤骄，Coiliamystus(linaeus)属緋形目，瓣科，骄属，称为凤尾鱼、肉骄等。其为 沿海中型鱼类，栖息于港湾、河口附近。80年代W来年平均产量为1961. 3吨，约占长江口鱼 邮类总产量的48. 6%。凤尾鱼肉中含15-20%的蛋白质，其氨基酸组成比较合理，且脂肪含 量低，是一种优质的蛋白质资源。目前我国主要将凤尾鱼制成罐头出售，产品远销东南亚和 欧美等国，深受广大消费者喜爱，但罐头产品的附加值较低，没有最大程度利用运些优质的 海洋蛋白资源。因此，有必要对凤尾鱼进行精深加工，提升其价值。W凤尾鱼为原料，通过 生物可控酶解的方法制备具有改善记忆功效的生物活性肤，对提升凤尾鱼的附加值和拓展 应用领域都具有重大的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的首要目的在于提供一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肤的制备方 法。
[0008] 本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的凤尾鱼美拉德肤。
[0009] 本发明的再一目的在于提供上述的凤尾鱼美拉德肤在食品、保健品或药品中的应 用。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0011] 一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肤的制备方法，包括W下步骤：
[0012] (1)将凤尾鱼去头去内脏，清净后绞成肉糜；
[0013] (2)将肉糜与其质量1-3倍的水混合，加入蛋白酶在45-60°C下酶解，酶解6-lOh 后，灭酶、离屯、，所得上清液为凤尾鱼酶解液；
[0014] (3)取凤尾鱼酶解液，按照其中蛋白含量的1.0-3.0% (w/w)添加还原糖，在 90-110°C的条件下反应1-化后取出冷却，得到凤尾鱼美拉德反应液；真空浓缩、喷雾干燥 后得到凤尾鱼美拉德肤；
[0015] 步骤（2)所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、膜酶或Alcalase2.化中的一种W上，W凤 尾鱼肉糜的质量为计算基准，蛋白酶总添加量为0. 5-1. 0%;
[0016] 步骤（3)所述的还原糖为食品级葡萄糖、木糖或核糖中的一种，优选核糖；
[0017] 步骤（3)所述的真空浓缩，是将凤尾鱼酶解液浓缩至固形物含量30-50%，然后进 行减压浓缩。
[0018] 由上述方法制得的凤尾鱼美拉德肤可用于制备预防、治疗记忆退化的食品、保健 品和药品。
[0019] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0020] (1)本发明首先采用生物酶解技术最大程度释放凤尾鱼蛋白中的具有改善记忆作 用的蛋白肤，然后通过美拉德反应进一步提升其生物功效。同时，美拉德反应亦可改善酶解 产物的风味，去除海洋产品的鱼腥味，产生令人愉悦的香味。
[0021] (2)本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染、蛋白回收率高，所得改善记 忆肤活性强，风味佳，可广泛应用于食品领域中。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 [002引本发明实施例中海洋鱼肤与PC12细胞&02损伤保护实验方法如下：
[0024]PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铭细胞瘤细胞株，由上海细胞库购入。采用Du化ecco's ModifiedEagleMedium培养基培养，其中加入10%胎牛血清（FB巧，1%的青霉素。在5% C〇2浓度，37°C下进行培养。传代Ξ次后，进行过氧化氨损伤试验。采用96孔板培养细胞， 细胞浓度在1.5X105细胞/孔。细胞首先与不同浓度的肤样品进行共同培养12小时后，换 取新鲜的培养基。进而采用过氧化氨损伤化后采用相差显微镜观察细胞形态，并采用MTT 法检测细胞存活率。 阳0巧]MTT法，又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活 细胞线粒体中的班巧酸脱氨酶能使外源性3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-dipheny Itetrazoliumbromide(MTT)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲琐（Formazan)并沉积在细 胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚讽（DMS0)能溶解细胞中的甲琐，用酶联免疫检测仪在 490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，Μ?Τ结晶形 成的量与细胞数成正比。 阳0%] 采取250μL(终浓度在0. 5mg/mL)的ΜΤΤ加入到96孔板中，与待测样品避光共培 养地之后，将96孔板中旧的培养基吸出，加入250μLDMSO溶解甲琐。采用酶标仪570皿 检测甲琐浓度，计算细胞存活率。
[0027]
[0028]其中：
[0029]A实验为加了样品和过氧化氨的细胞；
[0030] A对照为只加了相同体积PBS的PC12细胞。
[0031] 本发明实施例中，动物行为学测定方法如下：
[0032] 通过Morris水迷宫法及跳台观察多肤产品对东赏窘碱致学习记忆获得障碍模型 小鼠学习记忆能力的影响。Morris水迷宫是一种常被用于晒齿类动物神经认知疾病模型的 验证和神经认知治疗可行性评估的方法，其优点是能提供大量的实验参数，较系统全面地 考察实验动物的空间认知过程，客观反应动物的认知水平，且能较好地减少感觉和运动功 能障碍对测定的干扰。 阳〇3引受试对象：
[0034]SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，20-22g，购自广州中医药大学实验动物中屯、，合格证 号：SCXK(粤）2008-0020
[0035] 阳性药物：
[0036] 化拉西坦片：广东华南药业集团有限公司，批号121004 ;
[0037] 试验试剂和仪器：
[003引氨漠酸东赏窘碱注射剂：广州白云山明兴制药有限公司，批号130401 ;
[0039] 生理盐水注射剂：江西科伦药业有限公司，批号D121018E;
[0040] 无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司（分析纯），批号GB/T678-2002
[0041] 电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司，型号化204
[0042]XZC-5A型小鼠跳台仪：山东省医学科学院设备站，编号0012;
[0043] Morris水迷宫视频分析系统：上海移数科技有限公司，编号0017625。 W44] 试验方法： W45] 样品对东赏窘碱致学习记忆障碍小鼠空间学习和记忆能力的影响（Morris水迷 宫实验）
[0046]定位航行实验（placenavigation)
[0047] 定位航行实验是让动物通过空间线索学习平台的位置，实验进行5天，每天训练4 次。实验前一天将小鼠置于水迷宫中自由游泳2min，W熟悉水性。训练第一天为可见移动 平台，此间将平台设高于水面1-2畑1，并在平台上插入带红色小旗子使动物能识别，每训练 一次将平台顺序移动。第2-5天为固定隐藏平台期，此时平台设于SE点，低于水面1-2畑1。 训练时小鼠从随机从现象点处面向池壁入水，视频跟踪系统记录其在60s内首次寻找到平 台并且停留3秒W上的所需时间，记录为逃避潜伏期（escapelatency)。训练期间，阳性 对照及给药各组腹腔注射氨漠酸东赏窘碱注射液1.Omg/kg，模型和正常组给予等量生理盐 水，30min后入水训练，连续5天。 柳4引 空间探索实验（probetest)
[0049] 用于测试动物的学习记忆能力，定位航行实验结束次日开始，此期间撤掉水池中 的安全平台。给药第15天起，小鼠从测试点放入水池中，测定其60s内在平台象限的游泳 时间。末次给药比后，小鼠放入水中游泳，计算机定位跟踪系统记录小鼠60s内游泳轨迹。
[0050] 样