品对东赏窘碱致学习记忆障碍小鼠空间学习和记忆能力的影响（跳台实验）
[0051] 水迷宫实验结束次日进行跳台实验。末次给药后，模型对照组和受试药组分别腹 腔注射氨漠酸东赏窘碱1.Omg/kg，正常对照组腹腔注射相应体积生理盐水，30min后进行 跳台训练。实验时，将动物置于暗室，适应环境3min，然后立即通W36V电流，动物跳至铜 栅时即受到电击，为错误反应，其正确反应是跳回安全区。如此训练5min，记录5min错误 次数。24h后重复测试，先将跳台装置通W36V电流，然后将动物放在安全台上，记录小鼠 5min内跳下平台的潜伏期和错误次数。 阳0巧 实施例1
[0053] 一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肤及其制备方法，包括W下步骤： 阳054] (1)凤尾鱼去头去内脏，清洗干净后，放入揽肉机中制成肉糜；
[0055] 似加入肉糜质量2倍的水，加入鱼肉糜质量0.25%的木瓜蛋白酶和0.25%的 Alcalase2.化，然后在60°C下保溫水解，当酶解化后，95°C加热15min灭酶，冷却后在 35(K)r/min下离屯、lOmin，收集上清液，得到凤尾鱼蛋白酶解液；
[0056] 做向凤尾鱼蛋白酶解液中添加其蛋白质量1.0%的核糖，在90°C下反应沈，然后 冷却至室溫，得到凤尾鱼美拉德反应液。
[0057] (4)采用真空浓缩法将凤尾鱼美拉德反应液浓缩至固形物含量为40%;通过喷雾 干燥，得到凤尾鱼美拉德肤1。
[0058] 当凤尾鱼美拉德肤1浓度为Img/ml时，可使得经&〇2损伤的PC12细胞存活率达 至IJ79. 75%。
[0059] 实施例2
[0060] 一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肤及其制备方法，包括W下步骤： 阳061] (1)凤尾鱼去头去内脏，清洗干净后，放入揽拌机中制成肉泥； 阳06引 似加入肉糜质量1倍的水，添加肉糜质量0.27%的木瓜蛋白酶，0.27%的膜酶和 0.27%的水解蛋白酶，在55°(：下酶解化，然后在95°(：下加热15111111灭酶，冷却后在3500以min下离屯、lOmin，收集上清液，得到凤尾鱼蛋白酶解液； 阳06引 （3)向凤尾鱼蛋白酶解液中添加其蛋白质量2. 0%的木糖，在100°C下反应1.化， 然后冷却至室溫，得到凤尾鱼美拉德反应液。
[0064] (4)采用真空浓缩法将凤尾鱼美拉德反应液浓缩至固形物含量为30%;通过喷雾 干燥，得到凤尾鱼美拉德肤2。 阳0化]当凤尾鱼美拉德肤2浓度为Img/ml时，可使得经&〇2损伤的PC12细胞存活率达 至IJ82. 32%。
[0066] 实施例3
[0067] 一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肤及其制备方法，包括W下步骤：
[0068] (1)凤尾鱼去头去内脏，清洗干净后，放入揽拌机中制成肉泥； W例 似加入肉糜质量3倍的水，添加肉糜质量0. 33%的木瓜蛋白酶，0. 50%的膜酶和 0. 17%的水解蛋白酶，在45°C下酶解lOh，然后在95°C下加热15min灭酶，冷却后在3500r/min下离屯、lOmin，收集上清液，得到凤尾鱼蛋白酶解液；
[0070] (3)向凤尾鱼蛋白酶解液中添加其蛋白质量3.0%的葡萄糖，在110°C反应1.化， 然后冷却至室溫，得到凤尾鱼美拉德反应液。
[0071] (4)采用真空浓缩法将凤尾鱼美拉德反应液浓缩至固形物含量为50% ;通过喷雾 干燥，得到凤尾鱼美拉德肤3。
[0072] 当凤尾鱼美拉德肤3浓度为Img/ml时，可使得经&〇2损伤的PC12细胞存活率达 至IJ77. 21%。 阳〇7引 对比例1
[0074] 采用常规方法（非本发明方法）水解凤尾鱼制备蛋白肤，包括W下步骤：
[00巧](1)凤尾鱼去头去内脏，清洗干净后，放入揽拌机中制成肉泥；
[0076] 似加入肉糜质量1倍的水，添加肉糜质量0. 27%的木瓜蛋白酶、0. 27%的膜酶和 0.27%的水解蛋白酶，在55°(：下酶解化，然后在95°(：下加热15111111灭酶，冷却后在3500以 min下离屯、lOmin，收集上清液，得到凤尾鱼蛋白酶解液；
[0077] (3)采用真空浓缩法将凤尾鱼蛋白酶解液浓缩至固形物含量为45% ;通过喷雾干 燥，得到凤尾鱼蛋白肤1。
[0078] 当凤尾鱼蛋白肤浓度为Img/ml时，使得经&〇2损伤的PC12细胞存活率为达 62. 12%。
[0079] 表1海洋鱼蛋白肤PC12细胞&〇2损伤保护实验比较（W
[0080]
[0081] *:表示样品与模型组比较於0. 05。
[0082] 表2Morrios水迷宫定向航行实验结果（
[0083]
[0084] #:表示模型组与正常组比较於0. 05 表示给药组与模型组比较於0. 05(η= 巧）。 阳0化]表3Morrios水迷宫空间捜索实验结果（-子±'？）
[0086]
[0087] #:表示模型组与正常组比较於0.05 表示给药组与模型组比较^0.05(n= 巧）。 阳〇8引表4跳台测试实验结果（別S)
[0089]
[0090] #:表示模型组与正常组比较於0. 05 表示给药组与模型组比较於0. 05 ;(η= 15)
[0091] 由表1可看出，采用本发明方法制备的改善记忆肤（凤尾鱼美拉德肤1-3)与采用 常规方法水解得到的凤尾鱼蛋白肤（凤尾鱼蛋白肤1)相比，可显著提高经&〇2损伤的细 胞的存活率。运主要是因为采用多酶协同水解凤尾鱼蛋白可释放出具有神经细胞保护作 用的谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸等的氨基酸，而通过美拉德反应可获得抗氧化活性更强的糖 肤，两者皆对PC12细胞具有较强的保护作用，从而有效改善氧化应激对PC12细胞的损伤作 用。而且，通过检测发现，采用本发明方法得到的凤尾鱼美拉德肤对细胞的保护作用明显强 于谷脫甘肤对细胞的保护作用率。 阳〇9引由表2可看出，正常小鼠经过5天的训练，寻找隐藏平台的时间（逃避潜伏期）越 来越短，而模型小鼠的逃避潜伏期显著提高，且经过5天的训练，逃避潜伏期基本不变，说 明模型小鼠的记忆功能受到损伤。喂食本发明制备的凤尾鱼美拉德肤（1-3)产品后，小鼠 寻找隐藏平台的时间明显缩短，尤其是凤尾鱼美拉德肤2的结果接近于商业药物化拉西坦 片的逃避潜伏期结果；而喂食采用常规的水解法制备的凤尾鱼蛋白肤只在训练第五天才表 现出逃避时间的显著性降低。
[0093] 表3中显示，与模型组比较，凤尾鱼美拉德肤1-3组小鼠潜伏期显著降低，平台穿 越次数明显增加；表4为小鼠跳台实验结果，小鼠经跳台训练24小时后，与模型组比较，凤 尾鱼美拉德肤1-3使得小鼠潜伏期显著延长、错误次数明显减少。
[0094] W上动物实验结果表明本发明方法制备的凤尾鱼美拉德肤与普通方法制备的凤 尾鱼蛋白肤相比，对小鼠由东赏窘碱致短期记忆获得障碍具有更好的改善作用，表明采用 本发明制备的凤尾鱼美拉德肤具有改善记忆的功效。
[0095] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 将凤尾鱼去头去内脏，清净后绞成肉糜； (2) 将肉糜与其质量1-3倍的水混合，加入蛋白酶在45-60°C下酶解，酶解6-10h后，灭 酶、离心，所得上清液为凤尾鱼酶解液； (3) 取凤尾鱼酶解液，按照其中蛋白含量的1.0-3. 0% (w/w)添加还原糖，在90-1KTC 的条件下反应l_2h后取出冷却，得到凤尾鱼美拉德反应液；真空浓缩、喷雾干燥后得到凤 尾鱼美拉德肽。2. 根据权利要求1所述的具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽的制备方法，其特征在 于：步骤（2)所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰酶或Alcalase2. 4L中的一种以上，以凤尾鱼 肉糜的质量为计算基准，蛋白酶总添加量为〇. 5-1. 0%。3. 根据权利要求1所述的具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽的制备方法，其特征在 于：步骤（3)所述的还原糖为葡萄糖、木糖或核糖中的一种。4. 根据权利要求1所述的具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽的制备方法，其特征在 于：步骤（3)所述的真空浓缩，是将凤尾鱼酶解液浓缩至固形物含量30-50%，然后进行减 压浓缩。5. -种凤尾鱼美拉德肽，其特征在于：是由权利要求1-4任一项所述的方法制备得到。6. 权利要求5所述的凤尾鱼美拉德肽在制备预防、治疗记忆退化的食品、保健品或药 品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽及其制备方法和用途，该方法包括以下步骤：将凤尾鱼绞成肉糜，加水混合，加入蛋白酶酶解，所得上清液为凤尾鱼酶解液；往酶解液中添加还原糖，在90-110℃的条件下反应1-2h后取出冷却，得到凤尾鱼美拉德反应液；真空浓缩、喷雾干燥后得到凤尾鱼美拉德肽。本发明首先采用生物酶解技术最大程度释放凤尾鱼蛋白中的具有改善记忆作用的蛋白肽，然后通过美拉德反应进一步提升其生物功效。同时，美拉德反应亦可改善酶解产物的风味，去除海洋产品的鱼腥味，产生令人愉悦的香味。
【IPC分类】A61P25/00, C07K2/00, A61K38/01, A23L33/18, C12P21/06, C07K1/14
【公开号】CN105255978
【申请号】CN201510671224
【发明人】赵谋明, 赵甜甜, 苏国万, 赵容钟, 赵强忠
【申请人】华南理工大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月13日