一种制备纯化抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白纯化领域，具体的设及一种适用于抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白的大 量制备及大规模生产纯化的方法。
【背景技术】
[0002] 血栓形成是肿瘤患者的常见并发症之一。肿瘤患者的血栓多为静脉血栓，约 10%~20%恶性肿瘤患者可发生深部静脉血栓形成（νΤ?)事件。1865年Trousseau首次 报道了胃癌患者易形成静脉血栓，掲示了恶性肿瘤和血栓之间的关系，之后人们将癌症患 者并发游走性静脉炎称为化ousseau综合征。Trousseau综合征的临床表现除游走性静脉 炎外，还包括VTE、脑血管事件、屯、肌梗死、周围动脉闭塞等，其中WVTE最常见。
[0003] 肿瘤发生与血栓形成的关系极为密切，血栓的形成在肿瘤转移、肿瘤血管生成等 机制中起着重要作用，据一项大宗病例研究报道，不同类型恶性肿瘤患者中静脉血栓形成 (νΤ?)的发生率为2. 74%~12. 10%，而并发VTE可能导致癌症患者死亡的发生率增加2~ 8倍。血栓形成可谓肿瘤患者的隐形杀手。因此，肿瘤并发血栓形成是一个不容忽视的课 题。
[0004] 金葡球菌肠毒素C2(staphylococcalenterotoxins,SEC2)是由金黄色葡萄球菌 产生的一类超抗原，可直接与抗原递呈细胞上的血1CII类分子和T细胞受体Vβ区结合，极 低浓度下即可刺激大部分Τ细胞增殖，使之释放多种细胞因子，产生强烈的免疫应答反应 和显著的肿瘤抑制作用，临床上应用于肺癌、直肠癌、肝癌、卵巢癌等恶性肿瘤的治疗。葡激 酶（staphylokinase，Sak)是典型的第Ξ代溶栓药物代表，与传统溶栓药物相比，葡激酶具 有纤维酶原激活能力强的特点，并且免疫原性低，特异性高、过敏反应少，是目前相对较可 靠和安全的屯、血管疾病治疗药物。
[000引基于SEC2的广谱抗肿瘤活性和Sak的高效溶栓作用，现有技术中已有将金黄色 葡萄球菌肠毒素C2和葡激酶融合并成功表达抗肿瘤溶栓双效融合蛋白，然而现有技术中 研究的重点都在表达蛋白和验证其抗肿瘤溶栓活性上，而对其能大量制备和纯化研究的较 少，鉴于抗肿瘤溶栓双效融合蛋白的功能作用，如能大量制备及大规模生产纯化抗肿瘤溶 栓双效嵌合蛋白，则具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明提供一种能大量制备和纯化抗肿瘤溶栓双效融合蛋白的方 法。
[0007] 本发明采用的技术方案是：一种制备纯化抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白的方法，包括 如下步骤：
[0008] 1)取含有抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白基因的重组菌，按1-2%的接种量接种于新鲜 LB培养基中，摇瓶培养至0D值为0. 5-0. 6。
[0009] 优选的，接种量为2%。
[0010] 所述的新鲜LB培养基的初始PH为6. 5-7. 5,优选的，PH为7. 5。
[0011] 2)加入诱导剂，于30-37°C下诱导4-化，8000巧m，离屯、lOmin，将沉淀于-20°C冷冻 10-1地后，用平衡缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶，用细胞超声粉碎仪破碎菌体，800化pm， 离屯、lOmin，收集上清液。
[0012] 所述的诱导剂是浓度为0. 2-1.OmM异丙基-β-D-硫代化喃半乳糖巧，优选的，诱 导剂浓度为0. 6mM。
[0013] 优选的，诱导溫度为33°C。
[0014]所述的平衡缓冲液是 50mMNaH2P〇4、300mM化Cl、lOmM咪挫、pH8. 0。
[001引如用0. 45um的过滤膜对上清液过滤，经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，得到带组氨酸 标签的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白溶液。具体为：
[0016] 3.1)化-饥^亲和层析柱：将储存于20%乙醇中的化勺京脂糖胶混匀，灌入到柱子 中，待Ni2+琼脂糖胶沉降；沉降后用1倍柱体积的蒸馈水对柱子进行润洗，再用1倍柱体积 的LysisBuffer平衡柱子，得到Ni-NTA亲和层析柱；
[0017] 3. 2)上样：将步骤2)获得的上清液过0. 45um的过滤膜后，低速上样；
[0018] 3. 3)洗涂：上样后再用2倍柱体积的WashBuffer平衡柱子，洗涂除去样品中的 杂蛋白；
[0019] 3. 4)洗脱：用ElutionBuffer进行洗脱，收集洗脱峰，得到带组氨酸标签的抗肿 瘤溶栓双效嵌合蛋白溶液。
[0020] 所述的LysisBuffer由 50mM化H2P〇4、300mMNaCl、lOmM咪挫、pH8. 0 组成。 [00引]所述的WashBuffer由 50mM化H2P〇4、300mMNaCl、20mM咪挫、pH8.ο组成。
[0022] 所述的ElutionBuffer由 50mM化H2P〇4、300mMNaCl、250mM咪挫、pH8. 0 组成。
[0023] 4)将带组氨酸标签的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白溶液用蒸馈水稀释，超滤除盐后， 再用肠激酶缓冲液稀释，再超滤浓缩，最后用肠激酶酶切去除组氨酸标签，再经过亲和层析 柱得到纯化的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白。具体为：
[0024] 将带组氨酸标签的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白溶液用蒸馈水稀释10倍后，倒入超 滤仪内超滤浓缩，再用肠激酶缓冲液稀释10倍后，用超滤仪超滤浓缩，然后再将超滤后的 带组氨酸标签的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白溶液与肠激酶混合，在37°C酶切16小时，最后再 经过用1倍柱体积的LysisBuffer平衡的Ni-NTA亲和层析柱，得到纯化的抗肿瘤溶栓双 效嵌合蛋白。
[00巧]所述的肠激酶缓冲液包括 50mMTris-HCl、lmMCaCl、0. 1%Tween-20、pH8. 0 组 成。
[0026] 上述的一种制备纯化抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白的方法，所述的含有抗肿 瘤溶栓双效嵌合蛋白基因的重组菌是：含有重组质粒祀T28a-Δsak-Δsec2的重 组大肠杆菌、含有重组质粒祀T28a-Δsec2-Δsak的重组大肠杆菌、含有重组质粒 pET28a-〇ct-Asak-Δsec2的重组大肠杆菌、含有重组质粒祀T28a-〇ct-Asec2-Asak的 重组大肠杆菌、含有重组质粒祀T28a-sak-linke;r-sec2的重组大肠杆菌或含有重组质粒 祀T28a-sec2-linker-sak的重组大肠杆菌。
[0027] 本发明的有益效果是：采用本发明的方法，活化后的重组菌在最优培养条件下，能 迅速生长，经最优诱导条件诱导产出大量目的蛋白，最后经过纯化后得到大量抗肿瘤溶栓 双效融合蛋白。
【附图说明】
[0028] 图1是实施例1不同条件下抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白Δ SAK-Δ SEC2培养条件优 化图。
[0029] 图2是实施例2不同条件下抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白ASEC2-ASAK培养条件优 化图。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1制备纯化抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白Δ SAK-Δ SEC2的方法
[0031](一）制备方法如下
[0032] 1)取含有重组质粒祀T28a-Δsak-Δsec2的重组大肠杆菌，于Kan抗性平板划线 培养后，挑取单菌落接种于含有Kan的培养液中，在37°C摇床上培养12小时。按1-2%接种 量转接于含装液量l〇〇-150ml新鲜LB培养基的500ml摇瓶中，LB培养基的PH为6. 5-7. 5， 37°C180巧m摇瓶培养，至0D值为0. 5-0. 6。
[0033] 2)加入0. 2-1.OmM诱导剂（异丙基-β-D-硫代化喃半乳糖巧），于30-37°C下诱 导4-化，至0D值为0. 5-0. 6,8000巧m，离屯、lOmin，并用蒸馈水洗一次，将沉淀于-20°C冷冻 1化后，取出沉淀，用平衡缓冲液（50mMNaH2P〇4、300mM化Cl、10mM咪挫、P册.0)将沉淀悬 起，加入溶菌酶，用细胞超声粉碎仪破碎菌体，细胞超声粉碎仪的功率为400W，Is破碎，2s 间隔破碎，然后8000巧m，离屯、lOmin，收集上清液。
[0034] 3)用0.45um的过滤膜对上清液