0倍体积的0. 01~0. 1mol/L的憐酸氨二钢溶液中浸泡2~3山 每隔6h更换一次溶液，大量蒸馈水清洗至中性，再用四层纱布过滤渐干，于4°C存放备用。
[0028] 实施例2海蜜胶原蛋白提取工艺的优化 (1) 胶原蛋白提取率的测定：采用国标GB/T9695.23-2008中径脯氨酸的测定方法，通 过径脯氨酸含量来间接定量胶原蛋白，胶原蛋白转换为径脯氨酸的转换系数为11. 1。W标 准物k径脯氨酸的浓度（μg/mL)为横坐标，W吸光值A560为纵坐标，绘制标准曲线，得线 性回归方程A560 = 0. 2193C+ 0. 011，R= 0. 9993 ; (2) 胶原蛋白Ξ螺旋结构完整性的测定：采用SDS-PAGE的方法分析胶原蛋白Ξ螺旋结 构是否被破坏。分离胶浓度为7. 5%，浓缩胶浓度为3. 5〇/〇; (3) 最佳酸种类的确定：在4°C、1.0wt.%胃蛋白酶添加量、料液比（m/V)l:2.0和提取 时间24h条件下考察不同提取剂(冰乙酸、盐酸、巧樣酸和乳酸）对胶原蛋白提取率及结构 完整性的影响，最佳酸种类为巧樣酸（图1-2); (4) 最适提取溫度的确定：在1. 0wt. %胃蛋白酶添加量、0. 05mol/L巧樣酸为提取剂、 料液比（m/V) 1:2. 0和提取时间12h条件下考察不同溫度（4~30°C)对胶原蛋白提取率及 结构完整性的影响，最适提取溫度为15°C(图3-4); (5) 酸浓度的确定：在15°C、1.0wt. %胃蛋白酶添加量、料液比（m/V) 1:2. 0和提取时 间6h条件下比较不同巧樣酸浓度（0.00~0.08mol/L)对胶原蛋白提取率的影响，最适巧 樣酸浓度为0. 05mol/L(图5); (6) 提取时间的确定：在15°C、1. 0wt. %胃蛋白酶添加量、0. 05mol/L巧樣酸为提取剂 和料液比（m/V) 1:2.0条件下比较不同提取时间（0~14h)对胶原蛋白提取率的影响，最适 提取溫度为8h(图6); (7) 料液比的确定：在15°C、1. 0wt. %胃蛋白酶添加量、0. 05mol/L巧樣酸为提取剂、提 取时间8h条件下比较不同料液比（m/V) (1:1. 0~1:8. 0)对胶原蛋白提取率的影响，最适 料液比为1:2.0 (图7); (8) 酶添加量的确定：在15°C、0. 05mol/L巧樣酸为提取剂、料液比（m/V)l:2. 0和提取 时间8h条件下考察、0. 00~2. 00wt. %胃蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响，最适胃 蛋白酶添加量为1.50% (图8); (9) 在上述单因素实验的基础上，W料液比（因素A)、酸浓度（因素B)、加酶量（因素 C)和提取时间（因素D)为考察因素，选取合适的Ξ水平，W胶原蛋白提取率为目标函数，选 用正交表Lg(34)进行正交实验。确定主次因素为B〉D〉A〉C，确定最佳提取工艺为巧樣酸浓 度0. 05mol/l、胃蛋白酶添加量1. 5wt. %、料液比（m/V) 1:2. 0和提取时间8h，在该条件 下胶原蛋白提取率为97. 41%。
[0029] 表E因素水平表
实施例3海蜜胶原蛋白的分离纯化 (1) 向海蜜胶原蛋白粗提液中缓慢加入高浓度化C1溶液至终浓度为1. 0mol/l，揽拌 过夜； (2) 将粗提液于4°C条件下20000g离屯、15min,取沉淀重新溶于1mmol/L的巧樣酸 中，转入40kDa的透析袋，置于蒸馈水透析3d，期间每隔6h置换一次蒸馈水； (3) 将透析液于4°C条件下20000g离屯、15min,取沉淀冷冻干燥后即为胶原蛋白干 棉。
[0030] 实施例4海蜜胶原蛋白的理化性质特征 本发明提供的一种非变性海蜜胶原蛋白的提取及其制备方法，该方法制备的产品具有W下特征： (1) 由Ξ条相同α1链构成，结构为[α1]3,为典型水产类I型胶原，其α1链分子量 为 124kDa(图 9); (2) 氨基酸组成： 表里:海蜜胶原蛋白氨基酸组成
(3) 近紫外光区扫描图谱中，在238皿和274皿处有吸收峰（图10); (4) 将黏度变化50%时所对应的溫度定义为热变性溫度，则其热变性溫度为22. 7°C(图 11); (5) 傅里叶红外光谱中，在 3416cm\2931cm\l653cm\l555cm\l453cm\l397 cm1、1244cm1、1069cm郝 615cm1 处有吸收峰姻 12); (6) 将0. 05mol/L巧樣酸溶液中产品的溶解度定义为1，则其在1. 0mol/L的化Cl溶 液中的相对溶解度为6. 1% ;在抑值为6的溶液中的相对溶解度为7. 9% (图13-14)。
【主权项】
1. 一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下： (1) 将腌制的海蜇加工下脚料用清水冲洗几遍，再用蒸馏水浸泡，并每隔2h更换一次 蒸馏水，清洗1~2d，取出后搅拌机搅碎至无明显大颗粒，再用四层纱布过滤沥干； (2) 向搅拌获得的海蜇中加入5~20倍体积的丙酮浸泡1~2d，蒸馏水清洗至无味，再 加入5~20倍体积的0. 01~0. 1mol/L的磷酸氢二钠溶液浸泡2~3d，蒸馏水清洗至中性，滤 干； (3) 称取海蜇皮匀浆于含有1. 5~2. 0wt. %胃蛋白酶的0. 05~0. 07mol/L柠檬酸溶液 中，使料液比达到l:l.〇~l:3. 0，15~20°C提取8~12h; (4) 离心取上清液加入NaCl溶液，搅拌过夜；离心取沉淀重新溶于柠檬酸溶液中，转入 30~50kDa的透析袋，置于蒸馏水透析2~3d;冷冻干燥后即得胶原蛋白棉状固体。2. 根据权利要求1所述的一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2) 具体步骤为：添加丙酮至料液比1:5~1:20,静置过夜，大量蒸馏水清洗至无异味，再用四层 纱布过滤沥干；置于5~20倍体积的0. 01~0. 1mol/L的磷酸氢二钠溶液中浸泡2~3d，每隔 6h更换一次溶液，大量蒸馏水清洗至中性，再用四层纱布过滤沥干，于4°C存放备用。3. 根据权利要求1所述的一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（3) 中柠檬酸浓度0.05mol/L、胃蛋白酶添加量1.5wt.%、料液比（m/V) 1:2.0,在15°C下提取 时间8h。4. 根据权利要求1所述的一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（4) 中上清液的NaCl终浓度为1. 0mol/L，重溶的柠檬酸溶液浓度为1mmol/L。
【专利摘要】本发明提供了一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，属于生物技术领域，以腌制海蜇加工下脚料为原料，建立在中低温条件下采用柠檬酸为提取剂的非变性胶原蛋白提取工艺，得到较高纯度的胶原蛋白产品，有效提高海蜇产品附加值，实现低值海蜇高值化利用，为胶原蛋白的制备提供新来源。
【IPC分类】C12P21/06, C07K1/34, C07K14/78
【公开号】CN105255981
【申请号】CN201510769412
【发明人】林娟, 郑明星, 黄新华, 朱凡, 叶秀云
【申请人】福州大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月12日