，低溫灭菌，灭菌 溫度为50-90°C，然后冷却至室溫；将4.8g灭菌后的人参粉末与1.2g植物复合酶混匀；加 入化液体培养基和蒸馈水调节水分，固体发酵体系的水分为50-80% ;;充分混匀后密封， 置于40°C恒溫培养箱中发酵8d得到人参发酵产物；发酵产物用80%甲醇水溶液50-200mL， 在50°C超声提取10-50min超声提取，过滤，滤液减压浓缩；加入去离子水溶解后，用饱和正 下醇溶液萃取，减压浓缩，得到固体发酵后的人参皂巧提取物。经HPLC分析结果，人参发酵 物中人参皂巧Rgl含量为3. 02mg/g，Re含量为2. 98 mg/g，化1含量为7. 32mg/g，Rc含量 为4. 45mg/g，化2含量为4. 65mg/g，Rd含量为1. 07mg/g，PPD含量为 6.84mg/g。
[0017] 实施例3 配置化液体培养基（0.5g畑典1，1. Og馬册〇4,0.5g皿2?〇4,〇. 25gΜ拆〇4和1. Og酵母 粉，水1000ml，抑值7.0)，121°C灭菌15min，冷却至室溫；人参研磨成粉末，低溫灭菌，灭菌 溫度为50-90°C，然后冷却至室溫；将3.6g灭菌后的人参粉末与2. 4g植物复合酶混匀；加 入化液体培养基和蒸馈水调节水分，固体发酵体系的水分为50-80% ;充分混匀后密封，置 于50°C恒溫培养箱中发酵9d得到人参发酵产物；发酵产物用80%甲醇水溶液50-200mU在 50°C超声提取10-50min超声提取，过滤，滤液减压浓缩；加入去离子水溶解后，用饱和正下 醇溶液萃取，减压浓缩，得到固体发酵后的人参皂巧提取物。经HPLC分析结果，人参发酵物 中人参皂巧Rgl含量为2. 74mg/g，Re含量为2. 55mg/g，化1含量为7. 20mg/g，Rc含量为 4. 20mg/g，化2含量为4. 06mg/g，Rd含量为1. 37mg/g，PPD含量为 6.69mg/g。
[0018] 在实施例1、2、3中，所述的植物复合酶来自于蔬果、海藻类或谷类植物，其复合酶 成分包含淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶中的两种(含两种)W上酶类。本发明所采用的植物复合 酶可W市售直接获得，如北京盛世嘉明科技开发有限公司供应的植物复合酶。也可W分别 购得再配制成植物复合酶，如淀粉酶购自延边康德生物技术有限公司、蛋白酶购自陕西吴 辰生物科技有限公司、纤维素酶购自山东奥迪尔生物工程有限公司。
[0019] 在实施例1、2、3的实施过程中，调节固体发酵条件可W得到不同比例人参皂巧的 人参发酵产物，并且得到抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD)，其含量达到7. 73mg/g。
[0020] 测试实施例 准确称取一定量人参，分别按照实施例1-3提供的方法提取人参皂巧，同时将未发酵 的人参作为对照组提取人参皂巧，利用高效液相色谱（HPLC)测定人参皂巧含量。高效液相 色谱法测定人参皂巧的具体步骤为： a、 精密准确称取人参皂巧标准品，色谱级甲醇溶解，利用峰面积绘制标准曲线，如图1 所示，X:峰面积；y:浓度（mg/ml); b、 色谱条件为：流动相：水（A)-乙腊度)，洗脱梯度如表1所示；流速：lmL/min;检测 波长：203nm;柱溫：30°C;进样体积：10μL。
[0021] 表1为高效液相色谱流动相梯度表：
【主权项】
1. 一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，包括以下步骤： a、 将干人参研磨成粉末，低温灭菌，然后冷却至室温； b、 将经灭菌的人参粉末与植物复合酶混匀，植物复合酶添加量为10-70%，用无菌LL 液体培养基和蒸馏水调节水分，充分混匀后密封，置于恒温培养箱中发酵得到人参发酵产 物； c、 将人参发酵产物用80%甲醇水溶液超声提取，过滤，滤液减压浓缩，得人参皂苷粗提 物； d、 在人参皂苷粗提物加入去离子水溶解后，用饱和正丁醇溶液萃取，减压浓缩，得到 人参皂苷提取物，其中含有低糖链稀有人参皂苷或无糖链的抗肿瘤活性物质原人参二醇 (PPD)〇2. 根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述 的植物复合酶来自于蔬果、海藻类或谷类植物，其复合酶成分包含淀粉酶、蛋白酶、纤维素 酶中的两种以上酶类。3. 根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述 的a步骤中人参粉末灭菌温度为50-90 °C。4. 根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述 的b步骤中固体发酵体系的水分为50-80%，发酵时间为5-25h，发酵温度为20-70°C。5. 根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所 述的b步骤中无菌LL液体培养基由 0· 5gNH4C1，1. 0gΚ2ΗΡ04,0· 5gΚΗ2Ρ04,0· 25gMgSO# l.〇g酵母粉，水1000ml，pH值7.0构成。6. 根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述 的c步骤中在人参发酵产物中，加入80%甲醇水溶液50-200mL，在50°C超声提取10_50min。7. 根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述 发酵过程中，植物复合酶水解多糖链人参主皂苷的C-3和C-20位的糖基，生成低糖链稀有 人参皂苷或无糖链的抗肿瘤活性物质原人参二醇（pro)。
【专利摘要】本发明公开了一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，包括以下步骤：将干人参研磨成粉末，低温灭菌，然后冷却至室温；将经灭菌的人参粉末与植物复合酶混匀，用无菌LL液体培养基和蒸馏水调节水分，充分混匀后密封，置于恒温培养箱中发酵得到人参发酵产物；用80%甲醇水溶液超声提取，过滤，滤液减压浓缩，得人参皂苷粗提物；加入去离子水溶解后，用饱和正丁醇溶液萃取，减压浓缩，得到人参皂苷提取物，其中含有低糖链稀有人参皂苷或无糖链的抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD）。本发明工艺简单，操作方便，产品干燥容易，最重要的是在固体发酵的过程中实现人参皂苷的转化，得到稀有人参皂苷或抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD）。
【IPC分类】C12P33/00, C12P33/20
【公开号】CN105255984
【申请号】CN201510848529
【发明人】尹成日, 陈贺, 尹振浩, 宋晓琳, 金英今
【申请人】延边大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月30日