一种多标签抗原及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫印迹领域，尤其设及一种多标签抗原及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 免疫印迹技术是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的技术。对已知表 达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检 ，具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种 最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肤分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检 测等，因此免疫印迹技术在分子生物学研究中具有广泛的应用。
[0003] 在设计表达一种蛋白时，通常都会进行融合蛋白表达，即在蛋白质序列的N端或 者C端加入常用的标签序列，如6地is、Flag、Myc等。在做免疫印迹检测目的蛋白表达量时 通常只需检测目的蛋白上加入的标签序列即可，即用6*化S、Flag、Myc等标签单抗与目的 蛋白抗原进行免疫印迹反应，检测出的信号强弱即反应出目的蛋白表达量的高低。在运用 质粒转染真核细胞表达目的蛋白，或者利用病毒侵染来表达某种目的蛋白时，往往会遇到 蛋白表达量很微量或者不表达的情况，此时采用免疫印迹技术检测目的蛋白的表达情况很 可能不会出现明显的信号。在运种情况下，需要判断到底是目的蛋白真实的表达量很微量， 还是免疫印迹检测的反应体系出现问题导致没有出现信号。因此在做免疫印迹检测时通常 都需要设置阴性对照和阳性对照，在出现上述情况时，若阳性对照工作正常出现明显的反 应信号，则说明待研究的目的蛋白表达量确定是微量表达或者不表达。
[0004] 常用的标签有GST标签、HA标签、Str巧II标签、Flag标签、EGFP标签和His标签 等多种，在蛋白检测中，不同的目标蛋白根据其性质往往会选择不同的标签序列，现有技术 中多W单个标签作为阳性对照，运样当待测的多种蛋白质含有多个不同的标签序列时，贝U 需要多个相对应的阳性对照，即费时费力，也增加了检测成本。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺陷，本发明公开了一种多标签抗原，W满足大多数免疫印 迹反应设置阳性对照的需求。其技术方案如下：
[0006] 本发明提供了一种多标签抗原，包括9种标签，分别为GST标签、HA标签、T7标签、 V5标签、Myc标签、Str巧II标签、Flag标签、EGFP标签和His标签。
[0007] 优选地，该9种标签按照GST-HA-T7-V5-Myc-Str巧II-Flag-EGFP-His的顺序依次 串联。
[000引优选地，9种标签的序列为SEQIDN0. 1所示的核巧酸序列。
[0009] 本发明还提供了该多标签抗原的制备方法，包括W下步骤：
[0010](a)、人工合成SEQIDN0:1序列，并在SEQIDN0:1序列的5'端和3'端分别设置限 审IJ性内切酶位点，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体，测序，得到包含该沈QIDN0. 1序 列的质粒；
[0011] 化）、将步骤（a)中得到的质粒转化入表达菌株，进行蛋白表达，并使用儀柱纯化 该蛋白。
[0012] 优选地，步骤（a)中，设置在5'端的限制性内切酶位点为化OI，设置在3'端的限 制性内切酶位点为化OI。
[0013] 优选地，步骤（a)中，蛋白表达载体为祀T28a。
[0014] 优选地，步骤化）中，表达菌株为大肠杆菌表达菌株Rosseta值E3)。
[0015] 优选地，该多标签抗原的制备方法包括W下步骤：
[0016](a)、人工合成SEQIDN0:1序列，并在SEQIDN0:1序列的5'端和3'端分别设置限 制性内切酶位点化OI和化OI，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体祀T28a，测序，得 到包含该SEQIDN0:1序列的质粒祀T28a-MultiTag-G9;
[0017]化）、将步骤（a)中得到的质粒祀T28a-MultiTag-G9转化入大肠杆菌表达菌株 Rosseta(DE3)，进行蛋白表达，并使用儀柱纯化该蛋白。
[001引本发明还提供了一种多标签抗原的重组载体，即根据上述步骤（a)得到的pET28a-MultiTag-G90
[0019] 本发明还提供了上述多标签抗原在免疫印迹中的应用。
[0020] 本发明公开的多标签抗原，能够满足大多数免疫印迹反应设置阳性对照的需求。 其具有良好的兼容性和很强的免疫印迹反应特异性，并大大节省了检测成本。
[0021] W下将结合附图对本发明作进一步说明。
【附图说明】
[0022] 图1示出了本发明一个较佳实施例中制备的多标签抗原的免疫印记（Western blot)实验结果。
【具体实施方式】
[0023]W下通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。W下的实施例是对 本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
[0024] 1、MultiTag-Gg人工基因合成
[00巧]MultiTag-Gg包含 9 种常用检测标签，分别是GST、HA、T7、V5、Myc、StrepII、Flag、EGFP和His标签。具体的DNA序列分别是：
[0026]GST标签
[0027]
[0043]His标签
[0044]catcatcatcatcatcat 18
[0045] 将上述9种标签DNA序列依次串联在一起通过人工基因合成的方法构建出 MultiTag-Gg完整序列，并在此DNA序列5'端加上化OI限制性内切酶位点CCATGG，3'端 加上化OI限制性内切酶位点CTCGAG，通过化OI和化OI双酶切、割胶回收、T4连接酶连 接克隆至蛋白表达载体祀T28a。MultiTag-Gg完整编码区为1566bp，共含有522个氨基酸， 表达蛋白的理论分子量为5991抓a.
[0046] 2、MultiTag-G9蛋白的表达与纯化
[0047] 将测序正确的祀T28a-MultiTag-G9质粒转化入大肠杆菌表达菌株 Rosseta值E3)，挑取单菌落接种至50mlLB液体培养基，加入卡那霉素终浓度50ug/ml和氯 霉素34ug/ml双抗性筛选，37 °C，200巧m培养过夜。第二天按照2 :100比例转接至250ml LB液体培养基，加入卡那霉素终浓度50ug/ml和氯霉素34ug/ml双抗性筛选，共转接4瓶， 37°C，200rpm培养至菌液0D600检测数值为0. 8时加入诱导剂异丙基-0 -D硫代半乳糖巧 使其终浓度为0. 1-0. 5mM，诱导培养4h后，4°C700化pm离屯、收集菌体。将此菌体按照每克 加入40ml的比例悬浮于20mMTris.Cl,P册.0,300mM化Cl,10%Glycerol裂解缓冲液，超 声前加入终浓度ImM苯甲基横酷氣，超声波破碎仪进行菌体破碎。超声裂解条件为超声3 秒间隔5秒，30%超声功率，超声15min。当菌液变得清亮时离屯、收集上清液，取样进行聚丙 締酷胺凝胶电泳检测，并采用儀柱纯化MultiTag-Gg蛋白，具体纯化操作步骤参照NiNTA Beads6FF说明书进行，获得纯度约95%的MultiTag-Gg蛋白（得到的MultiTag-Gg蛋白 浓度为 350ug/ml)。
[004引3、MultiTag-Gg的免疫印迹应用
[0049] 纯化好的MultiTag-Gg进行聚丙締酷胺凝胶电泳，按照每泳道上样5ng MultiTag-G9蛋白进行聚丙締酷胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗结合，二抗结合，曝光显色进 行Westernblot免疫印迹反应。9种相对应的商品化标签单抗均能与MultiTag-Gg蛋白进 行灵敏而特异性的免疫印迹反应，结果如附图1所示。
[0050] 本发明获得的多标签抗原蛋白可作为免疫印迹反应的阳性对照，具有良好的兼容 性和很强的免疫印迹反应特异性。一种多标签抗原蛋白即可满足大多数常用标签免疫印迹 反应的阳性对照之需，兼容性强；其作为免疫印迹反应的阳性对照灵敏度高，只需低至5ng 蛋白即有明显的免疫印记（Westernblot)反应信号；免疫印迹反应只有单一目的条带信 号出现，特异性强。
[0051] W上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可W根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可W得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种多标签抗原，其特征在于，所述多标签抗原包括9种标签，分别为GST标签、HA 标签、T7标签、V5标签、Myc标签、Str印II标签、Flag标签、EGFP标签和His标签。2. 如权利要求1所述的多标签抗原，其特征在于，所述9种标签按照GST-HA-T7-V5-My c-Str印II-Flag-EGFP-His的顺序依次串联。3. 如权利要求2所述的多标签抗原，其特征在于，所述9种标签的序列为SEQIDNO. 1所 示的核苷酸序列。4. 如权利要求1所述的多标签抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下 步骤： (a) 、人工合成SEQIDNO: 1序列，并在所述SEQIDNO: 1序列的5'端和3'端分别设置限 制性内切酶位点，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体，测序，得到包含所述SEQIDNO. 1 序列的质粒； (b) 、将步骤（a)中得到的所述质粒转化入表达菌株，进行蛋白表达，并使用镍柱纯化 所述蛋白。5. 如权利要求4所述的多标签抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤（a)中，设置在 所述5'端的限制性内切酶位点为NcoI，设置在所述3'端的限制性内切酶位点为XhoI。6. 如权利要求4所述的多标签抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤（a)中，所述蛋 白表达载体为pET28a。7. 如权利要求4所述的多标签抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤（b)中，所述表 达菌株为大肠杆菌表达菌株R〇sseta(DE3)。8. 如权利要求1所述的多标签抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下 步骤： (a) 、人工合成SEQIDNO: 1序列，并在所述SEQIDNO: 1序列的5'端和3'端分别设置限 制性内切酶位点NcoI和XhoI，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体pET28a，测序，得 到包含所述SEQIDNO: 1序列的质粒pET28a-MultiTag-G9 ; (b) 、将步骤（a)中得到的所述质粒pET28a-MultiTag-G9转化入大肠杆菌表达菌株 Rosseta(DE3)，进行蛋白表达，并使用镍柱纯化所述蛋白。9. 一种多标签抗原的重组载体，其特征在于，所述重组载体为根据权利要求8所述的 步骤（a)得到的pET28a-MultiTag-G9。10. -种根据权利要求1或2所述的多标签抗原在免疫印迹中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种多标签抗原，该多标签抗原包括9种标签，分别为GST标签、HA标签、T7标签、V5标签、Myc标签、StrepII标签、Flag标签、EGFP标签和His标签，这9种标签按照GST-HA-T7-V5-Myc-StrepII-Flag-EGFP-His的顺序依次串联。本发明还公开了该多标签抗原的制备方法及其在免疫印迹中的应用。本发明中公开的多标签抗原，可以满足大多数免疫印迹反应设置阳性对照的需求，具有良好的兼容性和很强的免疫印迹反应特异性。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/70, G01N33/68, C12R1/19
【公开号】CN105296478
【申请号】CN201510821610
【发明人】曹平生
【申请人】翌圣生物科技（上海）有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月23日