一种生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种3-班巧酷化晚的制备方法，尤其是设及一种生物转化制备3-班 巧酷化晚的方法。
【背景技术】
[0002] 尼古下（nicotine)，又称烟碱，是烟草中最主要的生物碱，同时也是卷烟中的有害 成分之一，是吸烟产生烟癒和依赖性的主要因素。在卷烟工业中产生了大量含有尼古下的 "有害的危险废物"，其中的尼古下能够通过地下水或者空气进入环境中，会对环境及人类 健康造成极大的危害。
[0003] 我国是卷烟生产大国，在烟草加工过程中会产生约20%~30%废次烟叶，除此之 外各烟厂中积存的大量烟末，W及大量丢弃的上部烟叶和烟花等，运些烟草工业下脚料的 利用率很低，废弃后不仅造成浪费，还对环境产生污染。从运些烟叶种植及卷烟加工中产生 的下脚料中提取尼古下的技术已经发展比较成熟，从传统的水蒸气蒸馈法，二次萃取法到 "绿色"新型分离技术超临界萃取法，通过运些手段提取出尼古下，既可W减少其对环境污 染，又可W利用提出的尼古下作为医药和生物农药产品开发的工业原料。
[0004] 3-班巧酷化晚（3-succino^-py;ridine，SP)，是假单胞菌属代谢尼古下的一种中 间产物，该化合物通过化学修饰后可W作为合成某些药物和农药的前体，具有较高的利用 价值。目前，有关3-班巧酷化晚生产的研究报道还不充分，如何有效获得3-班巧酷化晚成 为人们希望解决的问题。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供一种生物转化制备3-班巧酷化晚的方法，包括W下 步骤：
[0006] 步骤一、底物的获取：将含尼古下的液体作为生物转化反应的底物；
[0007] 步骤二、构建生物转化用的菌株：将能代谢尼古下的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)的spmA基因敲除，得到恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)基因工程菌；
[0008] 步骤S、菌株培养与收集：将步骤二中得到的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)基因工程菌进行培养后收集菌体全细胞作为生物催化剂；
[0009] 步骤四、转化反应：将步骤=中收集的菌体全细胞与步骤一中的底物在P册.0~ 10. 0 (优选地是抑7. 0~9. 0)，20~45°C溫度下，120~18化pm振荡条件下反应，直至尼古 下完全被降解后终止反应，或者定时向反应液中补加底物，维持尼古下浓度在Ig/L W上反 应6~15小时；
[0010] 步骤五、产物分离：将步骤四反应结束后的产物在5000~1000化pm转速下离屯、 10~30分钟，取上清液置于真空度0. 08~0.1 MPa, 45~65°C的条件下减压蒸馈至原体积 的1/20~1/50,加入盐酸调节抑在2. 0~4. 0,静置、沉淀，然后用抽滤方法去除水溶液， 将沉淀干燥，得到3-班巧酷化晚。其中优选地是静置待3-班巧酷化晚充分沉淀。最后干 燥得到的3-班巧酷化晚为白色粉末。步骤一与步骤二和步骤=是独立分别进行的，不存在 先后顺序。
[0011] 进一步地，步骤一W废次烟叶作为生物转化的原料，利用水浸提废次烟叶获得烟 叶浸提液或利用二次萃取的方法从废次烟叶中获得尼古下提取液，烟叶浸提液或尼古下提 取液作为生物转化反应的底物。
[0012] 其中，步骤一中的烟草浸提液的获取方法是：将废次烟叶和纯水按照质量比 1:10~15混合，在50~60°C下揽拌处理3~5小时，过滤除去废次烟叶，获得烟草浸提液。
[0013] 其中，步骤一中的尼古下提取液的获取方法是：将废次烟叶烘干后粉碎成烟末，将 烟末与蒸馈水按照1:10~1:15混合均匀，用氨氧化钢调节抑在11~14,揽拌2~4小时 后静置12~24小时，过滤除去滤渣获得含有烟碱的滤液，加入滤液体积的1/5~1/10氯 仿进行萃取，萃取溫度为35~40°C，抑控制在11~14,揽拌萃取2~4小时后加入滤液 体积的1/5~1/10稀硫酸进行反萃，稀硫酸的抑为1~4,利用分液漏斗除去有机相，获得 硫酸烟碱水溶液，即为尼古下提取液。
[0014] 进一步地，步骤二中的恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)是于2005年04月18 日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCCM205038的菌株。运里被 命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)S16。具体保藏信息可见ht1:p://www.cctcc. o;rg/sci/mic;robe_common/sea;rchl_result.地P?ptzyh= 1542C0001WHM205038。
[0015] 进一步地，步骤二中的恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)基因工程菌的具体构 建方法是包括W下步骤：
[0016] 步骤甲、PCR扩增spmA基因：W恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)CCTCCM 205038为模版，spm-F和spm-R为引物进行PCR扩增获得PCR产物；spm-F引物序列（SEQ IDNO. 1)为CCACGTCGACCAAGTTAACTGGTTATGCGAC,含有酶切位点为SalI;spm-R引物序列 (沈QIDNO. 2)为CCACGAATTCAGTCCTTGGCCGAAACTTTGC，含有酶切仿点为EcoRI；
[0017] 步骤乙、质粒构建与转化：将步骤甲中的PCR产物和穿梭质粒分别用限制性内切 酶SalI和EcoRI进行酶切，获得酶切产物，并回收、连接酶切产物得到带有PCR产物的 穿梭质粒；利用热激法将带有PCR产物的穿梭质粒转化到大肠杆菌中，再经过酶切及测序 验证，得到供体菌；
[0018] 步骤丙、双亲杂交：将步骤乙中得到的供体菌和W恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)CCTCCM205038作为受体菌的两菌株通过双亲杂交的方法获得恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida)基因工程菌。
[0019] 进一步地，步骤=中菌株培养包括W下=个步骤：
[0020] 步骤曰、斜面培养：将步骤二中的恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)基因工程 菌接种到固体斜面LB培养基，25~37-°C培养10~24小时，固体斜面LB培养基组含有 1%~3%琼脂糖和50~lOOmg/L卡那霉素；
[0021] 步骤b、种子培养：将步骤a中斜面上长势良好的菌体在无菌的环境中转接到LB 液体培养基或者甘油液体培养基中，在25~37-°C培养8~24小时，获得种子液，LB液体 培养基和甘油液体培养基中均含有卡那霉素50~lOOmg/L和尼古下0. 5~1. 5g/L; 阳0巧步骤C、放大培养：将步骤b中的种子液按照体积比1%~5%接种量转接到LB液 体培养基或者甘油液体培养基中，25~37°C下120~20化pm培养8~24小时到对数生长 中期，LB液体培养基和甘油液体培养基中均含有50~lOOmg/L卡那霉素和0. 5~I. 5g/L尼古下。
[0023] 进一步地，步骤a~C中的菌体培养溫度为29~3rC。步骤a中的菌体培养时间 为10~14小时。步骤b和C中的菌体培养时间为12~16小时。步骤b和C中的培养基 中的尼古下浓度为0. 8~1. 2g/L。
[0024] 进一步地，步骤四中的菌体全细胞参与反应时的初始浓度是600nm下OD值为5~ 15个光密度，优选地是8~11个光密度；步骤一中的尼古下在步骤四中参与反应时的初始 浓度是1~5g/l，优选地是2~4g/L;W上初始浓度均用水调制获得。
[00巧]在本发明的生物转化制备3-班巧酷化晚的方法的另一实施方式中，还包括步骤 六：产物鉴定：将步骤五中获得的3-班巧酷化晚用高效液相色谱她LC)检测其纯度，用液 相-质谱联用巧SI-M巧和核磁波谱（NMR)的方法鉴定其结构。
[0026] 进一步地，步骤六中的NMR检测分别检测"CNMR和iHNMR，用AvanceIII400核磁 共振仪分析，溶剂为二甲基亚讽。步骤六中的ESI-MS用Agilent6230质谱仪分析，溶剂为 甲醇。
[0027] 进一步地，步骤四还包括反应期间每小时取样，用薄层层析CTLC)或者高效液相 色谱检测3-班巧酷化晚的生成情况；薄层层析的反应展层剂中氯仿：乙醇：甲醇：0. 5M氨 氧化钢的体积比为30:15:2:1. 5 ;高效液相色谱的检测条件是=AgilentllOO高效液相色谱 仪配备XDB-C18色谱柱，流动相中0.IM硫酸：乙腊的体积比为85:15,流速为0. 5血/min， 检测波长为254nm，柱溫为30-°C;步骤六中的高效液相色谱的检测条件与步骤四中的高效 液相色谱的检测条件相同。
[00測进一步，步骤四中的转化反应发生在只有恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)基 因工程菌、底物尼古下和溶剂蒸馈水存在的反应体系中。
[0029] 本发明将微生物菌株基因的定向改造、废次烟叶中尼古下的提取与3-班巧酷 化晚的制备有机的结合在一起，利用一株经定向改造后的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)基因工程菌作为生物催化剂，高效而稳定的降解尼古下并且积累单一的代谢中间 物3-班巧酷化晚。本发明借助基因工程菌高效且特异性的生物催化功能，解决了野生型 菌株在转化过程中产物3-班巧酷化晚很难积累且易被相关酶降解的问题。本发明提供的 3-班巧酷化晚制备的方法，具有成本低廉，催化反应体系简单，产物单一易于分离纯化，反 应耗时短、效率高的优点。
[0030] 本发明提