制备麦角硫因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物资源、生物工程、发酵工程及天然产物的生物合成领域。更具体 地，本发明涉及一种W更高的产量制备麦角硫因的方法。
【背景技术】
[0002] 麦角硫因化-Ergothioneine,EGT)是一种稀有的天然手性氨基酸，作为生物体内 重要的生理活性物质，起着抗氧化，防止紫外福射损伤，调节细胞内的氧化还原反应，莖合 二价金属离子，参与细胞内的能量调节等诸多生物学功能，是一种多功能的细胞生理保护 剂（刘埼，姜文侠，杨萍，周涛.麦角硫因一多功能的生理细胞保护剂[J].天然产物研究 与开发，2013, 25 (增刊）：160-164)。麦角硫因是通常认为安全的（generallyreco即ized assafe,GRA巧产品，性能稳定，在医药、生物医学、食品、保健食品、食品添加剂和化妆品等 行业具有重要的应用价值和广阔的应用前景。
[0003] 由于目前麦角硫因的制备成本高，限制了其应用。与化学合成法和天然生物提取 法相比，利用食用菌深层发酵制备麦角硫因，可W通过建立高强度发酵过程控制策略，提高 麦角硫因的积累量，实现大规模的高效生产，降低生产成本，而且具有产品安全等优势，是 合成麦角硫因的发展方向（刘埼，张维亚，姜文侠，梅保良，周涛.麦角硫因生物合成技术的 研究进展[幻.2013年国际氨基酸产业发展高峰论坛论文集.2013 :22-27)。
[0004] 日本PramvadeeTepwong等利用香茹(Xentinulaedodes)菌丝体深层发酵制备麦 角硫因，发酵第15天时发酵液中麦角硫因的产量为23.6mg/L(PramvadeeTepwong,Anupam Giri,FumitoSasaki.Mycobialenhancementofergothioneinebysubmerged cultivationofediblemushroommyceliaanditsapplicationasanantioxidative compound[J] ?FoodQiemistry，2012, 131:247 - 258);韩国WiYoungLee等利用紫黑灵 芝（Ganodermaneo-japonicum)菌丝体发酵合成麦角硫因，发酵结束时发酵液中麦角硫 因白勺含量达 57. 5mg/L(WiYoungLee,Eung-JunPark,JinKwonAhn.Supplementationof methionineenhancedtheergothioneineaccumulationintheGanodermaneo-japonicum mycelia[J].ApplBiochemBiotechnol, 2009, 158:213-221);台湾黄龄谊和QiiLh-Hung Liang对杏鲍茹巧Ieurotuseryngii)菌丝体进行液体发酵培养，培养结束后，发酵液 中麦角硫因的产量分别达62. 2mg/L(黄龄谊.高麦角硫因含量么杏鲍茹菌丝体深层培 养及其生理活性巧].台湾：中兴大学，2010)和60. 4mg/L(CMh-HungLiang，Ling-Yi Huang,Kung-JuiHo,etal.Submergedcultivationofmyceliumwithhighergothioneine contentfromtheculinary-medicinalkingoystermushroomPleurotuseryngii(higher basidiomycetes)anditscomposition[J].InternationalJournalofMedicinal Mushrooms, 2013, 15(2) :153-164);姜文侠等利用禮皮侧耳巧Ieurotusostrea化s)菌丝 体发酵制备麦角硫因，通过对发酵培养基和发酵控制工艺的优化，发酵液中麦角硫因的含 量达到135. 7mg/L(姜文侠，刘埼，周涛.生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法[P]. CN201210392417.8)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是进一步提高中国发明专利申请CN201210392417.8中麦角硫因的 发酵产量，提供一种改进的制备麦角硫因的方法。将中国发明专利申请CN201210392417.8 的全部内容引入本文W供参考。
[0006] 在中国发明专利申请CN201210392417.8中，公开了一种制备麦角硫因的方法，包 括如下步骤：
[0007] 1)将糖皮侧耳CGMCCNo. 6232的固体菌种（优选PDA斜面菌种）接种至液体种子 培养基，在19~3TC摇床100~20化pm培养至少3天，制备种子液；
[0008] 2)将种子液按4~20%的接种量（V/V)接种至发酵培养基，然后在19~3rC摇 床100~20化pm培养至少6天，得到糖皮侧耳菌丝体发酵液；
[0009]3)发酵结束后，将菌丝体发酵液升温至50~IOOC，W 0~60化pm揽拌浸提10~ lOOmin，麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到细胞外的发酵液中。
[0010] 所述的液体种子培养基的组成为；玉米粉15~50g/L(优选25~40g/L)、豆巧粉 10~35g/L(优选15~25g/L)、a-淀粉酶20~80U/L(优选30~65U/L)、磯酸二氨钟 1~6g/L(优选2~4. 5g/L)、硫酸镇0. 2~5g/L(优选0. 2~3g/L)，其余为水。
[0011] 所述的发酵培养基的组成为：甘油10~80旨/1，酪蛋白腺10~40g/l，磯酸二氨钟 2~4g/l，硫酸镇0. 5~2g/l，其余为水。
[0012] 本发明的巧术方案
[0013] 根据本发明，使用糖皮侧耳（PleurotusostreaUis)TIB.BPE. 10010,作为发酵菌 种发酵制备麦角硫因。该菌种已于2012年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中必（简称CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCCNo. 6232。
[0014] 根据本发明进一步提高麦角硫因发酵产量的制备方法包括如下步骤：
[0015] (a)将糖皮侧耳CGMCCNo. 6232的菌种接种至种子培养基，培养制备种子液，其中 所述种子培养基使用豆饼粉作为氮源；和
[0016] (b)将种子液接种至发酵基础培养基，然后培养得到糖皮侧耳菌丝体发酵液。
[0017] 优选地，糖皮侧耳CGMCCNo. 6232获自PDA斜面培养基；种子培养基为；玉米粉 15~50g/L(优选25~40g/L)、豆饼粉5~35g/L(优选15~35g/L)、a-淀粉酶20~ 80U/L(优选30~65U/L)、磯酸二氨钟1~6g/L(优选2~4. 5g/L)、硫酸镇0. 2~5g/L(优 选0. 2~3g/L)，其余为水；发酵基础培养基为；甘油10~95g/L、酪蛋白腺10~80g/L、磯 酸二氨钟2~4g/L、硫酸镇0. 5~2g/l，其余为水。
[0018] 优选地，步骤（a)中的培养操作在19~3rC进行至少3天，步骤化）中的培养操 作在19~3rc进行至少6天，且步骤化）中的接种量为4~20 (V/V) %。
[0019] 进一步，向发酵基础培养基中添加W下的任一种或多种物质：NH4CI、NH4NO3、叶酸、 维生素Bl(VBl)、剛巧了酸、巧樣酸、丙丽酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜碱、组氨酸、半脫氨酸、 蛋氨酸、吐温（tween,例如吐温60和吐温80)和司盘（span,例如司盘80)。该添加步骤可 W在发酵前或发酵的过程中进行。
[0020] 优选地，向发酵基础培养基中添加W下量的任一种或多种物质；NH4CIO. 5g/L~ 12g/L、NH4NO3O. 5g/L~lOg/L、叶酸 0. 08g/L~2. 56g/L、VBlO.Olg/L~0.8g/L、剛巧了酸 0.Img/L~4mg/L、巧樣酸 0.Olg/L~0.8g/L、丙丽酸 0. 05g/L~4. 5g/L、谷氨酸IJimol/L~100ymol/L、天冬氨酸 0. 05g/L~9g/L、甜菜碱 50mmol/L~250mmol/L、组氨酸 0.Immol/L~3mmol/L、半脫氨酸 2mmol/L~45mmol/L、蛋氨酸 3mmol/L~45mmol/L、吐温 0. 5g/L~50g/L(例如吐温 602g/L~50g/L、吐温 800. 5g/L~40g/L)和司盘 0. 2g/L~ lOg/L(例如司盘 800. 2g/L~lOg/L)。
[0021] 本发明的巧术效果
[0022] 使用豆饼粉作为糖皮侧耳CGMCCNo. 6232发酵合成麦角硫因的种子培养基的 氮源，适当提高发酵培养基中甘油和酪蛋白腺的含量，向发酵基础培养基中添加NH4CI、 NH4NO3、叶酸、维生素Bl(VBl)、剛巧了酸、巧樣酸、丙丽酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜碱、组氨 酸、半脫氨酸、蛋氨酸、吐温和司盘中的任意一种或多种化合物，可显著提高麦角硫因的发 酵水平，产物的产率比对照组大幅度提高。
【具体实施方式】
[0023] 本发明的W下实施例仅用来说明实现本发明的【具体实施方式】，送些实施方式不能 理解为是对本发明的限制。其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
[0024] 实验仪器、材料：摇床（IS-RDV3,美国精琪有限公司）；高效液相色谱仪 (Agilentl260,AgilentTechnologies);水浴锅（TW20,Jul油O公司）；数字式加热磁力揽 拌器（MIXControl20,WIGGENS公司）；电子分析天平（AB204-S，METTLERTOLEDO);活塞式 真空泉（V610,化emVak);超声波清洗机（SB-5200D型，宁波新芝生物科技股份有限公司）； 0.22um孔径微孔滤膜（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；中空纤维超滤膜（天津爱生膜过 滤技术有限公司）。
[00巧]主要试剂：麦角硫因对照品（纯度>98%，BiomolInternationalInc.) ;PDA培养 基度ecton，DickinsonandCompany);甲醇等试剂为市售色谱纯；磯酸二氨钟、硫酸镇、巧 樣酸购自国药集团化学试剂有限公司；玉米粉购自梅河口市兴达米业有限责任公司；豆饼 粉和豆巧粉购自北京中棉紫光生物科技有限公司；甘油购自天津市风船化学试剂科技有限 公司；酪蛋白腺购自偃师市百家工贸有限公司；NH4CLNH4NO3、丙丽酸和司盘80购自天津市 光复精细化工有