联过度。
[0034] 在步骤3)中，在将固定液滴入氯化钙水溶液中时，形成凝珠小球，以形成白色凝 珠小球为最佳，此时小球比较饱满，具有弹性，包埋效果好。
[0035] 实施例2-9
[0036] 各实施例与实施例1基本相同，不同之处在于表1。
[0037] 表 1
[0038]
[0040] 各实施例的卤醇脱卤酶的固定率及其固定后ATS-5生成率如表2。
[0041] 表 2
[0042]
[0043] 注：其中"第一次"是将获得的海藻酸钠固定的卤醇脱卤酶直接用于催化合成 (R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生成率，"第二次"是在第一次合成完成后回收的海藻酸钠 固定卤醇脱卤酶用于催化合成（R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生成率。
[0044] ATS-5生成率的测定：
[0045] 仪器：国产福立9790气相色谱仪（浙江温岭福立分析仪器有限公司）
[0046] 载气：氮气
[0047] 检测器：氢火焰离子化检测器
[0048] 色谱柱：毛细管色谱柱
[0049] 打开气瓶和减压阀，调节压力为0. 5MPa左右一打开气体净化器开关一调节总压， 载气压力为0. 3MPa，调节载气流速为30ml/min，先通载气，再通执导桥流一打开电源、加热 开关一设定气相色谱仪起始温度为120°C，保持2min，采用程序升温，以20°C /min升温至 250°C，保持15min -打开N2000在线工作站，点击采样通道1，输入实验信息一单机数据采 集，再点击查看基线按钮，待基线平直后，用微量注射器取〇. 2 μ L试样注入注样器，按下采 集数据按钮。试样注入瞬间汽化后，由载气携带，经过色谱柱得到完全分离，被分离的组分 依次进入检测器系统，由检测器转换为电信号送至记录仪汇出色谱图，待色谱峰出完后，停 止米集。
[0050] 根据保留值定性法，每个组分都有恒定的保留值，而ATS-4大概在5min中左右出 峰，间隔一分钟ATS-5出峰，根据峰面积即可得出ATS-4反应剩余量和ATS-5的生成量。
[0051] (1)峰高乘半峰宽法：据对称色谱峰，计算峰面积
[0052] A = 1. 065*h*W1/2
[0053] h峰高
[0054] A峰面积
[0055] ff1/2半峰宽
[0056] (2)归一化法：各组分校正因子近似相等
[0057] ffx= A./CAi+A^. . . . +An)
[0058] ff,各组分的质量分数
[0059] A,各组分的峰面积
[0060] 取反应液0. 5ml，注入0. 5ml乙酸乙酯，摇勾，由气象色谱仪检测试样，根据色谱图 的峰面积得到ATS-4反应剩余量和ATS-5的生成量。
[0061 ] ATS-5生成率由下式计算：
[0062] 生成率=ATS-5生成量V(ATS-4反应剩余量)+ATS-5生成量（％ ))。
[0063] HHDH固定率的测定
[0064] 通过计算得到固体和上清液中ATS-5的生成率后，由下式计算：
[0065] 固定率=4h时固体中ATS-5的生成率V(4h时固体中ATS-5的生成率 (% )+4h时上清液中ATS-5的生成率（％ ))
[0066] 以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完 全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术 性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
【主权项】
1. 一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成（R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的工艺，包括 如下步骤： 1) 配制7. 5-30U/mL的卤醇脱卤酶溶液待用；配制质量分数为2. 5-4.Owt%的海藻酸钠 水溶液待用；配制体积分数为〇. 75-1. 5 %的戊二醛水溶液待用； 2) 将戊二醛水溶液滴入海藻酸钠水溶液和卤醇脱卤酶溶液的均匀混合的溶液中，并在 搅拌的条件下反应5h，得固定液，所述戊二醛水溶液、海藻酸钠水溶液和卤醇脱卤酶溶液的 体积比为1:20:20 ; 3) 将固定液逐滴滴入过量的l_4wt%的氯化|丐水溶液中，形成凝珠小球，固化lh后过 滤，得海藻酸钠固定卤醇脱卤酶； 4) 称取207g蒸馏水、1. 5-2. 5g氰化钠，逐一加入四口烧瓶中，并调节pH至7. 5-8. 5左 右； 5) 加入40-50g底物ATS-4,并升温，待温度大于46°C时加入15g海藻酸钠固定卤醇脱 卤酶，反应l-4h，调节pH为6. 90-7. 05,用有机溶剂萃取、精馏，得（R)-4-氰基-3-羟基丁 酸乙酯。2. 如权利要求1所述的一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成（R)-4-氰基-3-羟基 丁酸乙酯的工艺，其特征在于：所述卤醇脱卤酶溶液为从粗卤醇脱卤酶液中提取的卤醇脱 卤酶溶液。3. 如权利要求1或2所述的一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成（R)-4-氰基-3-羟 基丁酸乙酯的工艺，其特征在于：所述卤醇脱卤酶溶液的浓度为15U/mL。4. 如权利要求1所述的一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成（R)-4-氰基-3-羟基 丁酸乙酯的工艺，其特征在于：所述海藻酸钠水溶液浓度为3. 5wt%。5. 如权利要求1所述的一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成（R)-4-氰基-3-羟基 丁酸乙酯的工艺，其特征在于：所述戊二醛水溶液体积分数为1%。6. 如权利要求1所述的一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成（R)-4-氰基-3-羟基 丁酸乙酯的工艺，其特征在于：所述步骤2)中戊二醛水溶液为逐滴滴入海藻酸钠水溶液和 卤醇脱卤酶溶液的均匀混合的溶液。7. 如权利要求1所述的一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成（R)-4-氰基-3-羟基 丁酸乙酯的工艺，其特征在于：所述凝珠小球为乳白色凝珠小球。8. 如权利要求1所述的一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成（R)-4-氰基-3-羟基 丁酸乙酯的工艺，其特征在于：步骤5)的反应温度为47-52Γ。9. 如权利要求1所述的一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成（R)-4-氰基-3-羟基 丁酸乙酯的工艺，其特征在于：步骤5)的反应时间为4h。10. 如权利要求1所述的一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成（R) -4-氰基-3-羟基 丁酸乙酯的工艺，其特征在于：步骤5)的有机溶剂为乙酸乙酯或二氯甲烷。
【专利摘要】本发明涉及一种海藻酸钠固定卤醇脱卤酶催化合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的工艺，先将海藻酸钠与HHDH混合，用戊二醛交联后，用氯化钙包埋，固定化1h后，HHDH的固定率在46％以上，然后用固定化酶与底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(ATS-4)反应，反应4h后，ATS-5生成率为在70％以上，回收HHDH后，第二次进行催化反应，ATS-5生成率在35％以上。本发明提供的海藻酸钠固定卤醇脱卤酶的方法，海藻酸钠对卤醇脱卤酶的固定速率快，固定率高，海藻酸钠固定卤醇脱卤酶在第一次催化合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯后，进行回收，依然能够保持较高的催化效率，固定效果好。
【IPC分类】C12P13/00, C12N11/04, C12N11/10
【公开号】CN105316369
【申请号】CN201510908339
【发明人】梁国斌, 汪斌, 周全法, 姚佳
【申请人】江苏理工学院
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年12月10日