酶法催化制备肌醇的方法及其产物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及酶法催化制备肌醇的方法，包括如下步骤：以葡萄糖为单位的多糖或者寡糖酶促转化为葡萄糖?1?磷酸；葡萄糖?1?磷酸酶促转化为葡萄糖?6?磷酸；葡萄糖?6?磷酸酶促转化为肌醇?1?磷酸；肌醇?1?磷酸酶促转化为肌醇。本发明还提供按照所述方法制备的肌醇产品。所述方法有效提高了肌醇的转化效率，且生产工艺简单，无污染，生产成本低。
【专利说明】
酶法催化制备肌醇的方法及其产物
技术领域
[0001 ]本发明涉及酶法催化制备肌醇的方法及其产物。
【背景技术】
[0002]环己六醇也被称为肌醇，是动物必需的生长因子，是细胞膜的组成成分之一。在医药领域，肌醇及其衍生物具有促进细胞生长、预防和治疗动脉硬化、胆固醇过高症等疾病的作用。在食品领域，肌醇常作为营养强化剂，能促进发育，具有抗氧化功能，与肉毒碱结合使用具有减肥功效。美国在1987年就推荐含奶婴儿食品中应加入一定量的肌醇。此外，肌醇还被用于饲料中以促进动物的生长和防止毛发脱落。
[0003]目前肌醇生产的主要方法是利用米糠或麸皮等底物提取植酸钙，然后加压水解制得。其产率极低，且存在生产设备要求高，污染环境等缺点。利用植酸酶等酶法水解植酸钙，肌醇得率与化学水解得率相当。
[0004]有文献及专利报道，以葡萄糖为底物，利用微生物发酵产肌醇。在大肠杆菌中导入来源于酿酒酵母的肌醇-1-磷酸合成酶，以及表达大肠杆菌自身的磷酸肌醇磷酸酶，从而使葡萄糖能被转化为肌醇。但在微生物细胞中，葡萄糖同时参与多个代谢途径以维持细胞的生长，此外，肌醇-1-磷酸合成酶催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-1-磷酸，葡萄糖-6-磷酸则由葡萄糖磷酸化得到，此过程需要消耗能量(ATP或磷酸烯醇式丙酮酸)，葡萄糖转化为肌醇的转化率较低。此外，由于细胞发酵液成分较复杂，从而从中纯化肌醇的过程也较复杂，成本较高。
【发明内容】
[0005]针对现存的化工生产肌醇的方法和微生物转化葡萄糖生产肌醇存在问题，本发明提供了酶法催化制备肌醇的方法，有效提高了肌醇的转化效率，且生产工艺简单，无污染，生产成本低。
[0006]作为本发明实施例的一个方面，涉及酶法催化制备肌醇的方法，包括如下步骤:以葡萄糖为单位的多糖或者寡糖酶促转化为葡萄糖-1-磷酸;葡萄糖-1-磷酸酶促转化为葡萄糖-6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸酶促转化为肌醇-1-磷酸;肌醇-1-磷酸酶促转化为肌醇。
[0007]作为实施例之一，以葡萄糖为单位的多糖或者寡糖酶促转化为葡萄糖-1-磷酸的过程中使用多糖磷酸化酶进行催化;葡萄糖-1-磷酸酶促转化为葡萄糖-6-磷酸的过程中使用己糖磷酸变位酶催化;葡萄糖-6-磷酸酶促转化为肌醇-1-磷酸的过程中使用肌醇磷酸合成酶催化;肌醇-1-磷酸酶促转化为肌醇的过程中使用磷酸肌醇磷酸酶催化。
[0008]在一种实施例中，多糖磷酸化酶、己糖磷酸变位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶同时加入反应体系。
[0009]在一种实施例中，多糖磷酸化酶、己糖磷酸变位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶先后加入反应体系。
[0010]所述多糖磷酸化酶可分为α葡聚糖(或糖原)磷酸化酶(EC2.4.1.1)，纤维糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.49)，纤维二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.20)，麦芽糖磷酸化酶(EC 2.4.1.8)，蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)，β-1，3-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.97 和 EC 2.4.I.30)，α-1，3-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.I.334)，β-1，2-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.333)，海藻糖磷酸化酶(EC 2.4.1.231和EC 2.4.1.64)，海带二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.31)，曲二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.230)，黑曲寡糖磷酸化酶(EC 2.4.1.279)等。本领域技术人员应根据底物的不同选择相对应的酶，其中底物优选为淀粉等α葡聚糖底物，因此对应的酶优选为α葡聚糖(或糖原)磷酸化酶(EC 2.4.1.1)。
[0011]所述己糖磷酸变位酶可以催化己糖-1-磷酸生成己糖-6-磷酸。已报道的可以催化葡萄糖-1-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸的酶主要属于两大超家族:磷酸己糖变位酶超家族，包括葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2和EC 5.4.2.5)，甘露糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.8)，氨基葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.10);卤代酸脱卤酶超家族，包括β葡萄糖磷酸变位酶(EC
5.4.2.6)。其中葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)的天然底物即为葡萄糖_1_磷酸，催化活性较高，因此优选葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)催化葡萄糖-1-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸的酶促反应。
[0012]所述肌醇磷酸合成酶(EC5.5.1.4)催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-1-磷酸。其催化分为两步:第一步，在NAD+的作用下，链状的葡萄糖-6-磷酸被氧化生成5-羰基-葡萄糖-6-磷酸，同时NAD+被还原生成NADH，随后，氧化产物发生烯醇化以及环化，产生2-肌醇单酮-1磷酸;第二步，NADH参与2-肌醇单酮-1磷酸的还原反应，生成肌醇-1-磷酸与NAD+。金属离子如Mg2+，Zn2+等或NH4+对酶有激活作用。该酶包含一个NAD+结合结构域，其催化需要加入NAD+作为辅酶，优选的是肌醇-1-磷酸合成酶。
[0013]所述磷酸肌醇磷酸酶主要催化磷酸肌醇水解产生肌醇。能催化该反应的酶主要是单磷酸肌醇磷酸酶(EC 3.1.3.25)，因此磷酸肌醇磷酸酶优选为单磷酸肌醇磷酸酶(EC
3.1.3.25)。此外，部分其他的酶也能催化此反应，包括磷酸-半乳糖磷酸酶(EC3.1.3.93),二磷酸果糖磷酸酶(EC 3.1.3.11)，糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)，植酸酶(EC 3.1.3.8和EC
3.1.3.26),酸性磷酸酶(EC3.I.3.2)。
[0014]作为本发明实施例的另一个方面，涉及一种酶法催化制备肌醇的方法，以葡萄糖为单元的多糖或寡糖为原料，在反应体系中，同时或者先后添加多糖磷酸化酶、己糖磷酸变位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶。
[0015]所述多糖磷酸化酶可分为α葡聚糖(或糖原)磷酸化酶(EC2.4.1.1)，纤维糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.49)，纤维二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.20)，麦芽糖磷酸化酶(EC 2.4.1.8)，蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)，β-1，3-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.97 和 EC 2.4.I.30)，α-1，3-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.I.334)，β-1，2-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.333)，海藻糖磷酸化酶(EC 2.4.1.231和EC 2.4.1.64)，海带二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.31)，曲二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.230)，黑曲寡糖磷酸化酶(EC 2.4.1.279)等。应根据底物的不同选择相对应的酶，其中底物优选为淀粉等α葡聚糖底物，因此对应的酶优选为α葡聚糖(或糖原)磷酸化酶(EC 2.4.1.1)。
[0016]所述己糖磷酸变位酶可以催化己糖-1-磷酸生成己糖-6-磷酸。已报道的可以催化葡萄糖-1-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸的酶主要属于两大超家族:磷酸己糖变位酶超家族，包括葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2和EC 5.4.2.5)，甘露糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.8)，氨基葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.10);卤代酸脱卤酶超家族，包括β葡萄糖磷酸变位酶(EC
5.4.2.6)。其中葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)的天然底物即为葡萄糖_1_磷酸，催化活性较高，因此优选葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)催化葡萄糖-1-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸的酶促反应。
[0017]所述肌醇磷酸合成酶(EC5.5.1.4)催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-1-磷酸。其催化分为两步:第一步，在NAD+的作用下，链状的葡萄糖-6-磷酸被氧化生成5-羰基-葡萄糖-6-磷酸，同时NAD+被还原生成NADH，随后，氧化产物发生烯醇化以及环化，产生2-肌醇单酮-1磷酸;第二步，NADH参与2-肌醇单酮-1磷酸的还原反应，生成肌醇-1-磷酸与NAD+。金属离子如Mg2+，Zn2+等或NH4+对酶有激活作用。该酶包含一个NAD+结合结构域，其催化需要加入NAD+作为辅酶，优选的是肌醇-1-磷酸合成酶。
[0018]所述磷酸肌醇磷酸酶主要催化磷酸肌醇水解产生肌醇。能催化该反应的酶主要是单磷酸肌醇磷酸酶(EC 3.1.3.25)，因此磷酸肌醇磷酸酶优选为单磷酸肌醇磷酸酶(EC
3.1.3.25)。此外，部分其他的酶也能催化此反应，包括磷酸-半乳糖磷酸酶(EC3.1.3.93),二磷酸果糖磷酸酶(EC 3.1.3.11)，糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)，植酸酶(EC 3.1.3.8和EC
3.1.3.26),酸性磷酸酶(EC3.I.3.2)。
[0019]作为本发明实施例的再一方面，涉及上述方法制备的肌醇产品，肌醇产品中含有葡萄糖、1-磷酸葡萄糖和/或6-磷酸葡萄糖。
[0020]与现有技术相比，本发明实施例至少实现了如下有益效果:
[0021]所述方法有效提高了肌醇的转化效率，纯度高，且生产工艺简单，无污染，生产成本低。
【附图说明】
[0022]图1是本发明实施例1中质粒pET26b_IN01表达载体图谱；
[0023]图2是本发明实施例1体外表达酶的大肠杆菌细胞超声裂解后上清SDS-PAGE检测结果图；
[0024]图3是本发明实施例1中INOl不同pH值对酶活性的影响；
[0025]图4是本发明实施例1中INOl不同温度对酶活性的影响；
[0026]图5是本发明实施例1中MIP不同pH值对酶活性的影响；
[0027]图6是本发明实施例1中MIP不同温度对酶活性的影响；
[0028]图7是本发明实施例1中PGM不同pH值对酶活性的影响；
[0029]图8是本发明实施例1中PGM不同温度对酶活性的影响；
[0030]图9是本发明实施例1中aGP不同pH值对酶活性的影响；
[0031 ]图10是本发明实施例1中aGP不同温度对酶活性的影响。
[0032]图2中所示:I为蛋白marker，2为未纯化的酶，3为经过热处理后的酶。
【具体实施方式】
[0033]原料与酶的选择
[0034]多糖原料为葡萄糖为单糖单位组成的多糖或寡糖。多糖包括(但不限于)以α糖苷键(主要为α-l，4_糖苷键)连接形成的α葡聚糖如淀粉、糖原，以及以糖苷键(主要为β-l，4_糖苷键以及β-1，3-糖苷键)形成的β葡聚糖如纤维素、海带多糖、酵母β葡聚糖等。寡糖则是指聚合度相对较低的上述多糖，可由上述多糖部分水解得到，如低聚麦芽糖，纤维糊精和环糊精等。
[0035]对于常温下溶于水的多糖原料，如水溶性淀粉和纤维二糖等，所述方法可以在低温、中温以及高温中进行，例如10°C-100°C之间。对于催化四步反应的酶也可以选择在低温、中温以及高温中有活性的酶，例如可以选择最适温度在30_40°C的四种酶。而对于常温下不溶于水的多糖原料，如玉米淀粉和红薯淀粉等，需要高温糊化才能溶于水，此时，所述方法必须在高温下进行，例如60-90 °C之间。酶的选择也随之变更为在高温下有较好活性和稳定性的酶。
[0036]由于淀粉成本最低，因此选在淀粉作为底物，淀粉溶于水时需要高温糊化，因此选择耐高温的酶。如果使用其他容易在常温下溶于水的多糖，则可以选择常温酶。
[0037]多糖磷酸化酶:可选择来源于微生物、植物和动物的多糖磷酸化酶。优选来源于嗜热微生物的多糖磷酸化酶，嗜热微生物包括Aqu if ex属、Thermus属、Rhodothermus属、Rumini c 1 stridium属、Methanococcus属、Methanocaldococcus属、Pyrobaculum属、Pyro coccus 属、Su lfolo bus 属、Thermo coccus 属、Thermoproteus 属、Thermo toga 属、Thermoanaerobacter 属、Caldi ce I Iulosiruptor 属、Thermobifida属。
[0038]己糖磷酸变位酶:可选择来源于微生物、植物和动物的己糖磷酸变位酶。优选来源于嗜热微生物的己糖磷酸变位酶，嗜热微生物包括Aquifex属、Aeropyrum属、Desulfurococcus属、Ignicoccus属、Pyrobaculum属、Pyrococcus属、Pyro1bus属、Rhodothermus 属、Rumini c 1stridium属、Sulfo 1bus 属、Thermococcus属、Thermoproteus属、Thermus 属、Vulcanisaeta 属、Methanococcus 属、Methanocaldococcus 属、Thermoanaerobac ter 属、Fervidobacteri um属、Ca I dice I Iu 1 sirup tor 属、Thermobifi da属、Thermob i f i da 属。
[0039]磷酸肌醇合成酶:可选择来源于动物、植物、微生物的磷酸肌醇合成酶，优选来源于嗜热微生物的磷酸肌醇合成酶。嗜热微生物包括Aeropyrum属、Archaeog 1bus属、Desu Ifuro Co c CUs属、Igni Co c CUs属、Rhodothermus属、Pyrobacul um属、Pyro coc CUs属、Pyro 1bus 属、Su Ifo 1bus 属、Thermo Co c CUs 属、Thermoproteus 属、Vu Icanisaeta属、Methanocaldococcus属、Thermobifida属。
[0040]磷酸肌醇磷酸酶:可选择来源于微生物、植物和动物的磷酸肌醇磷酸酶。优选来源于嗜热微生物的磷酸肌醇磷酸酶。嗜热微生物包括Aquifex属、Archaeog I obus属、Desulfurococcus属、Ignicoccus属、Methanococcus属、Methanocaldococcus属、Pyrobaculum属、Pyro 1bus属、Rhodothermus 属、Sulfo 1bus属、Thermo toga属、Thermus 属、Vulcanisaeta属、Thermob if ida属。
[0041 ] 实施例1
[0042]肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)在大肠杆菌中的表达
[0043]在NCBI上查找嗜热菌的肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)基因或蛋白，筛选最适生长温度在60-90°C的微生物，购买菌株提取基因组后扩增相关基因，或者直接人工合成相关基因，以Archaeoglobusfulgidus来源的肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)为例，其蛋白序列在NCBI上的编号GeneBank:AIG98795.1，将该序列交予基因合成公司合成对应的DNA序列，并在其两端分别加上EcoR 1-Nde I和Xho I酶切位点。将合成的DNA以及大肠杆菌表达载体如pET_26b ( + )分别利用Nde I以及Xho I酶切回收后，利用T4DNA连接酶16 °C连接过夜，取5yL连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子进行PCR验证以及测序验证，筛选到正确的转化子后，提取质粒，命名为pET26b-1N01，其质粒图谱如图1所示。将质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，挑选转化子，验证正确后-80 °C保存备用。
[0044]肌醇-1-磷酸合成酶的体外表达和检测:将上述验证正确的BL21(DE3)转化子加入5-1OmL LB培养基(I%蛋白胨，0.5%酵母提取物，I %氯化钠)中37°C，250rpm培养过夜，然后按照I %接种量接种到新鲜的LB培养基中37°C，250rpm活化10小时，按照I %-10%的接种量接种到发酵罐(TB培养基:1.2 %蛋白胨，2.4%酵母提取物，0.23 %磷酸二氢钾，1.25 %磷酸氢二钾，0.4% (v/v)甘油)中，37°C培养到OD6QQ达到8-10时，接入0.2-lmM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，约24小时后发酵结束。取少量细胞进行超声裂解后取上清SDS-PAGE检测，结果如图2所示，INOl在大肠杆菌细胞裂解的上清中较亮的条带，证明其有大量的可溶性表达肌醇-1-磷酸合成酶产生，其分子量约为44kD。
[0045]肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)在毕赤酵母中的表达
[0046]以Archaeoglobusfulgidus来源的肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)为例，将实施例1中合成的基因和以及毕赤酵母表达载体如PPICZaA分别用EcoR I和Xho I酶切回收后，利用T4DNA连接酶16°C连接过夜，取5yL连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子进行PCR验证以及测序验证，筛选到正确的转化子后，提取质粒。利用Pme I酶切质粒，将得到的线性化质粒转化毕赤酵母GS115，挑选转化子验证正确后-80°C保存备用。上述所有操作均按照pPICZa载体说明书进行。
[0047]肌醇-1-磷酸合成酶的体外表达:将转化子接入Yro培养基(2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖)中30°C，250rpm活化过夜，然后再次转接到新鲜的Yro培养基中培养16-24小时，然后按照5%-10%的接种量接入发酵罐(FM21培养基:二水硫酸钙1.5g/L，氢氧化钾
6.5g/L，七水硫酸镁19.5g/L，硫酸钾23.8g/L，85%磷酸溶液35mL/L)中，控制温度30°C，转速500rpm，溶氧大于20%，培养至溶氧显著上升时补加5%的甘油，继续培养至溶氧显著上升至接近100%后，维持30分钟，流加0.5%甲醇诱导，发酵周期约72小时。
[0048]磷酸肌醇磷酸酶(MIP)在大肠杆菌中的表达
[0049]先在NCBI上查找磷酸肌醇磷酸酶(MIP)基因和蛋白，筛选最适生长温度与整个酶催化体系温度一致的微生物，购买菌株提取基因组后扩增相关基因，或者直接人工合成相关基因。以Archaeoglobusf uIgidus来源的MIP进行人工合成为例，查找其蛋白序列为GeneBank:WP_010879859.1，送DNA合成公司合成对应的DNA(根据大肠杆菌密码子进行密码子优化)，在其序列两端分别加入Nde I和Xho I酶切位点，利用Nde I和Xho I对合成的基因以及表达载体如pET-26b( + )进行酶切回收后，利用T4DNA连接酶16°C连接过夜，取5yL连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子进行PCR验证以及测序验证，筛选到正确的转化子后，提取质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑选转化子，验证正确后-80°C保存备用。酶的表达与肌醇-1-磷酸合成酶(IN01)的相同。
[0050]α-葡聚糖磷酸化酶(aGP)在大肠杆菌中的表达
[0051]先在NCBI上查找α-葡聚糖磷酸化酶(aGP)基因和蛋白，筛选最适生长温度与整个酶催化体系温度一致的微生物，购买菌株提取基因组后扩增相关基因，或者直接人工合成相关基因。以Aquif ex aeolicus来源的aGP进行人工合成为例，查找其蛋白序列GenBank:AAC06896.1，送DNA合成公司合成对应的DNA(根据大肠杆菌密码子进行密码子优化)，在其序列两端分别加入Nde I和Xho I酶切位点，利用Nde I和Xho I对合成的基因以及表达载体如pET-26b( + )进行酶切回收后，利用T4DNA连接酶16°C连接过夜，取5yL连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子进行PCR验证以及测序验证，筛选到正确的转化子后，提取质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑选转化子，验证正确后-80 °C保存备用。酶的表达与肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)的相同。
[0052 ]己糖磷酸变位酶(PGM)在大肠杆菌中的表达
[0053]先在NCBI上查找己糖磷酸变位酶(PGM)基因和蛋白，筛选最适生长温度与整个酶催化体系温度一致的微生物，购买菌株提取基因组后扩增相关基因，或者直接人工合成相关基因。以Thermococcus kodakaraensis来源的PGM进行人工合成为例，查找其蛋白序列GeneBank:BAD85297.1，送DNA合成公司合成对应的DNA(根据大肠杆菌密码子进行密码子优化)，在其序列两端分别加入Nde I和Xho I酶切位点，利用Nde I和Xho I对合成的基因以及表达载体如pET-26b ( +)进行酶切回收后，利用T4DNA连接酶16 °C连接过夜，取5yL连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子进行PCR验证以及测序验证，筛选到正确的转化子后，提取质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑选转化子，验证正确后-80°C保存备用。酶的表达与肌醇-1-磷酸合成酶(IN01)的相同。
[0054]体外表达酶的纯化
[0055]将体外表达的肌醇-1-磷酸合成酶的大肠杆菌发酵液SOOOrpm离心20分钟收集菌体，加入水或磷酸缓冲液使其浓度达到100g/L，导入高压匀浆机中进行破碎，破碎后的酶液置于80°C水浴5分钟，离心去除杂蛋白后，可以去除大部分的杂蛋白，SDS-PAGE检测如图2所示，此时可以通过喷雾干燥得到粗酶粉，也可以进一步用Q柱纯化，用0.5M氯化铵进行梯度洗脱，得到较纯的肌醇-1-磷酸合成酶。
[0056]所述磷酸肌醇磷酸酶，所述α-葡聚糖磷酸化酶和所述己糖磷酸变位酶的纯化方法同肌醇-1-磷酸合成酶。
[0057]多糖磷酸化酶活性的测定
[0058]配置如下反应溶液:50mM HEPES缓冲液，5mM磷酸二氢纳，1mM氯化镁，0.5_5mM底物如淀粉和纤维糊精等。取上述溶液5mL加入10yL酶液，在最适温度反应5分钟后，迅速置于冰上终止反应。生成的葡萄糖-1-磷酸可以通过葡萄糖磷酸变位酶生成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸则可以在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与NAD+的作用下产生6-磷酸葡萄糖酸与NADH JADH在340nm处有吸收峰。因此可以通过测量NADH的量来间接测定葡萄糖-1-磷酸的量。具体反应条件如下:取500yL上述反应液，加入200U葡萄糖磷酸变位酶后，再加入500yL下述溶液:5μΜ葡萄糖-1，6-二磷酸，5mM NAD+，6U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。25-35°C反应5分钟后，340nm处测吸光值。
[0059]己糖磷酸变位酶活性的测定
[0060]配置如下反应体系:50mM HEPES缓冲液，1mM氯化镁，50μΜ葡萄糖-1，6-二磷酸，5mM葡萄糖-1-磷酸。加入酶液后在最适温度下反应5分钟，最终100°C煮5分钟或冰上放置5分钟以终止反应。将上述反应液200yL中加入800yL下述水溶液:0.5mM NAD+，2U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。25-35 °C反应5分钟后，340nm处测吸光值。[0061 ]磷酸肌醇磷酸酶活性的测定
[0062]采用钼蓝法，钼酸铵与磷酸反应生成磷钼酸，磷钼酸在还原试剂的作用下，生成蓝色的钼蓝，在700nm处有吸光值。配置如下溶液:显色液:试剂A:试剂B = 4:1。试剂A: 7.5g钼酸铵溶于400mL水中，缓慢加入22mL浓硫酸，定容至500mL，冰箱储存。试剂B:2.7%硫酸亚铁溶液，冰箱储存。底物溶液:50-100mM Tris-HCl，5_10mM氯化镁，ImM肌醇-1-磷酸。终止液:
5%三氯乙酸溶液。
[0063]酶活测定方法如下:1、取250yL酶液，加入ImL底物溶液，在最适温度下水浴10分钟，加入1.25mL终止液。2、加入2.5mL显色液。3、700nm处测吸光值。
[0064]肌醇磷酸合成酶活性的测定
[0065]配置如下溶液:50mM Tris-HCl，5mM葡萄糖_6_磷酸，1mM铵盐或二价金属盐，加入200yL酶液，加入50yL 2-10U肌醇单磷酸磷酸酶，5mM NAD+，在最适温度下反应10分钟，按照上述的钼蓝法测定磷酸的含量。
[0066]酶学性质的测定
[0067]测定不同温度，pH值对酶活性的影响，以体外表达的Archaeoglobusfulgidus的INOl为例，分别设置酶活测定体系的pH值为6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，利用上述酶活测定方法测酶活，结果如图3所示，分别设置酶活测定体系的温度为60°C，70°C，80°C，90°C，100°C，利用上述酶活测定方法测定酶活，结果如图3和图4所示，其最适反应条件为pH8.0，90°C，此时比酶活为10.5U/mg。同样方法测定其余三种体外表达酶的最适反应条件，如图5和图6所示，实施例3中体外表达的Archaeoglobusfulgidus来源的MIP最适反应条件pH8.0，90°C，最高比酶活为5.4U/mg;如图7和图8所不，实施例5中体外表达的Thermococcus kodakaraensis来源的PGM最适反应条件为pH7.0，90 °C，最高比酶活为620U/mg;如图9和图1O所示，实施例4中体外表达的Aquifex aeolicus来源的aGP的最适反应条件为pH 6.5，100°C，其最高比酶活为 7.5U/mg。
[0068]实施例2
[0069]使用实施例1所制备的酶进行实验。将淀粉底物用水调制成干物质含量为10%的淀粉乳，加入0.2M磷酸二氢钠，调节pH6.5，在65°C进行糊化。加入喷雾干燥得到的酶粉，其中<^?、？61、1勵1、11?按照酶活力单位等比例混合，加入量为10001]-100001]/1，以每升反应体系加入<^、?61、1勵1、11?四种酶均为100001]为例，按照活力测定的数据，在?!1 7.0，70°C条件下，其酶活分别为3U/mg、275U/mg、1.7U/mg、1.7U/mg。即混合酶中四种酶的酶量分别为3333mg、36mg、5882mg、5882mg。将混合酶加入淀粉乳中，维持温度不变，反应72小时后，肌醇转化率可达到62%。
[0070]实施例3
[0071 ]将淀粉原料用水调制成干物质含量为10%的淀粉乳，加入0.1M磷酸二氢钠，调节pH7.0，在750C进行糊化。加入喷雾干燥得到的酶粉，其中aGP(来源于Aquifex aeolicus)、PGM(来源于Thermococcus kodakaraensis)、INOl (来源于Archaeoglobusfulgidus)、MIP(来源于Archaeoglobusfulgidus)的加入量均为10000U，维持温度不变，反应72小时后，肌醇含量为67g/L，按照淀粉分子式(C6H1Q05)n，100g/L的淀粉如果完全转化为肌醇可以得到111g/L的肌醇，可以计算出肌醇转化率为62 + 111X100%=60%。
[0072]aGP和PGM来源于Thermus thermophilus，INOl来源于Archaeoglobusfulgidus，MIP 来源于 Thermo toga maritima，转化率62%。将 MIP替换为Thermus thermophilus 来源，转化率基本不变。
[0073]实施例4
[0074]将淀粉原料用水调制成干物质含量为10%的淀粉乳，加入0.5M磷酸二氢钠，调节ρΗ7.0。在90°C进行糊化。加入1000U/L的aGP(来源于Aquifex aeolicus)，反应24小时后，加入1000U/L的PGM (来源于Thermo Co ccus kodakaraensis)，反应24小时后，加喊调节pH为
8.0。加入 1000U/L 的 INOl (来源于 Archaeoglobusfulgidus)，反应 24 小时后，加入 1000U/L 的MIP(来源于Archaeoglobusfulgidus)，反应24小时。最终肌醇转化率为50%。
[0075]实施例5
[0076]选择其他在60_80°C有催化活性的酶，也可以催化淀粉底物产肌醇，如将淀粉原料用水调制成干物质含量为10 %的淀粉乳，加入0.IM磷酸二氢钠，调节pH 7.5，在75°C进行糊化后加入aGP(来源于Pyrococcusfur1sus，GeneBank: AFN04317.1)、PGM (来源于Pyrococcus horikoshii ,GeneBank:WP_010885014.1)、INOl(来源于Aeropyrumpernix，GenBank:BAA80516.1)、MIP(来源于Methanococcus jannaschii ,GenBank: Q57573.1)，加入量均为10000U，催化48小时后，肌醇产量为47g/L，肌醇转化率为42%，催化72小时后，肌醇含量产量为66g/L，转化率为59%。
[0077]实施例6
[0078]肌醇的纯化
[0079]以游离酶催化为例，催化完成后升温至100°C处理30分钟，待温度降至室温后，I升反应液中加入400mL乙醇沉淀蛋白以及未充分水解的多糖，3000g离心I小时后，在上清中加入5g活性炭(DACR0 G-60)，搅拌30分钟后，使用0.45μπι的过滤器，通过减压过滤由该滤液中滤出活性炭，同样的方法依次加入阳离子交换树脂(Amberlite IR120BH+型)和阴离子交换树脂(Amberlite IRA96SB 0Η—型)，最后经过乙醇沉淀、浓缩结晶即可得到纯的肌醇，其纯度达到95%以上。粗肌醇产物中特有的杂质为四种酶、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、单磷酸肌醇、葡萄糖和葡萄糖组成的寡糖。经纯化后，含有少量葡萄糖、1-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖。而利用传统方法利用六磷酸肌醇水解制备肌醇，杂质为肌醇上带不同数量的磷酸集团(如单磷酸肌醇、二磷酸肌醇等)。
【主权项】
1.酶法催化制备肌醇的方法，其特征在于，包括如下步骤:以葡萄糖为单位的多糖或者寡糖酶促转化为葡萄糖-1-磷酸;葡萄糖-1-磷酸酶促转化为葡萄糖-6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸酶促转化为肌醇-1-磷酸;肌醇-1-磷酸酶促转化为肌醇。2.权利要求1所述酶法催化制备肌醇的方法，其特征在于，以葡萄糖为单位的多糖或者寡糖酶促转化为葡萄糖-1-磷酸的过程中使用多糖磷酸化酶进行催化;葡萄糖-1-磷酸酶促转化为葡萄糖-6-磷酸的过程中使用己糖磷酸变位酶催化；葡萄糖-6-磷酸酶促转化为肌醇-1-磷酸的过程中使用肌醇磷酸合成酶催化;肌醇-1-磷酸酶促转化为肌醇的过程中使用磷酸肌醇磷酸酶催化。3.权利要求1所述酶法催化制备肌醇的方法，其特征在于，多糖磷酸化酶、己糖磷酸变位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶同时加入反应体系。4.权利要求1所述酶法催化制备肌醇的方法，其特征在于，多糖磷酸化酶、己糖磷酸变位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶先后加入反应体系。5.权利要求2-4任一所述酶法催化制备肌醇的方法，其特征在于，所述多糖磷酸化酶为α葡聚糖磷酸化酶，糖原磷酸化酶，纤维糊精磷酸化酶，纤维二糖磷酸化酶，麦芽糖磷酸化酶，蔗糖磷酸化酶，β_1，3-葡聚糖磷酸化酶，α-l，3-葡聚糖磷酸化酶，β_1，2-葡聚糖磷酸化酶，海藻糖磷酸化酶，海带二糖磷酸化酶，曲二糖磷酸化酶，黑曲寡糖磷酸化酶中的一种，所述己糖磷酸变位酶为葡萄糖磷酸变位酶，甘露糖磷酸变位酶，氨基葡萄糖磷酸变位酶和β葡萄糖磷酸变位酶中的一种，所述肌醇磷酸合成酶为肌醇-1-磷酸合成酶，所述磷酸肌醇磷酸酶为单磷酸肌醇磷酸酶，磷酸-半乳糖磷酸酶，二磷酸果糖磷酸酶，糖磷酸酶，植酸酶和酸性磷酸酶中的一种。6.权利要求5所述酶法催化制备肌醇的方法，其特征在于，所述多糖磷酸化酶为α-葡聚糖磷酸化酶;所述己糖磷酸变位酶为葡萄糖磷酸变位酶;所述肌醇磷酸合成酶为肌醇-1-磷酸合成酶;所述磷酸肌醇磷酸酶为单磷酸肌醇磷酸酶。7.酶法催化制备肌醇的方法，其特征在于，以葡萄糖为单元的多糖或寡糖为原料，在反应体系中，同时或者先后添加多糖磷酸化酶、己糖磷酸变位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶。8.权利要求7所述酶法催化制备肌醇的方法，其特征在于，所述多糖磷酸化酶为α葡聚糖磷酸化酶，糖原磷酸化酶，纤维糊精磷酸化酶，纤维二糖磷酸化酶，麦芽糖磷酸化酶，蔗糖磷酸化酶，β-l，3-葡聚糖磷酸化酶，α-l，3-葡聚糖磷酸化酶，β_1，2-葡聚糖磷酸化酶，海藻糖磷酸化酶，海带二糖磷酸化酶，曲二糖磷酸化酶，黑曲寡糖磷酸化酶中的一种，所述己糖磷酸变位酶为葡萄糖磷酸变位酶，甘露糖磷酸变位酶，氨基葡萄糖磷酸变位酶和β葡萄糖磷酸变位酶中的一种，所述肌醇磷酸合成酶为肌醇-1-磷酸合成酶，所述磷酸肌醇磷酸酶为单磷酸肌醇磷酸酶，磷酸-半乳糖磷酸酶，二磷酸果糖磷酸酶，糖磷酸酶，植酸酶和酸性磷酸酶中的一种。9.权利要求8所述酶法催化制备肌醇的方法，其特征在于，所述多糖磷酸化酶为α-葡聚糖磷酸化酶;所述己糖磷酸变位酶为葡萄糖磷酸变位酶;所述肌醇磷酸合成酶为肌醇-1-磷酸合成酶;所述磷酸肌醇磷酸酶为单磷酸肌醇磷酸酶。10.权利要求1-9任一方法所制备的肌醇产品，其特征在于，所述肌醇产品中含有葡萄糖、1-磷酸葡萄糖和/或6-磷酸葡萄糖。
【文档编号】C12P19/24GK105925643SQ201610398699
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】刘文山, 汪小锋, 汪卫
【申请人】武汉康复得生物科技股份有限公司