补齐延伸10 min后反应结束。琼脂糖电泳分析鉴定PCR产物。将样品及阳性和阴性对照一起电泳鉴定，完成后，将凝胶经溴化乙锭染色后在紫外灯下观察，比较各泳道电泳条带情况，以判定样品为受检样品是否带有致病突变。
[0018]上述技术方案中，所述引物是PCR技术中重要的组成部分，它是一小段单链DNA，作为DNA复制的起始点。
[0019]上述方案中，在运用PCR扩增方法时，将以上所列针对不同突变位点的一组引物中，突变模板配对引物与下游引物为一对，正常模板配对引物与下游引物为另外一对，这两对引物分别与该组对应检测位点基因型位置的DNA模板，PCR反应mix构成两个单独的反应体系；分别对2个单独的反应体系进行PCR扩增。
[0020]由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:
1，本发明采用特殊设计并经修饰的引物，其PCR产物特异性非常高。利用该基因检测方法，在完成PCR反应和凝胶电泳后，可直接观察产物条带的有无来判断男性不育症基因1个致病突变位点的基因型。
[0021]2，本发明操作简单，经济，无需测序，一般分子生物学实验室即可操作。
【附图说明】
[0022]附图1:本发明采用PCR扩增方法检测基因T141G位点得到的凝胶电泳图(第一组引物，三个样本)。
[0023]第1 泳道，lOObp DNA Ladder Marker,条带大小(bp)由上至下分别为 1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100(下同);第2泳道，样品 1，引物 T141G N F 和 T141GR配对的PCR产物电泳图；第3泳道，样品1，引物T141G M F和T141G R配对的PCR产物电泳图；第4泳道，样品2，引物T141G N F和T141G R配对；第5泳道，样品2，引物T141G ΜF和T141G R配对的PCR产物电泳图；第6泳道，样品3，引物T141G N F和T141G R配对的PCR产物电泳图；第7泳道，样品3引物T141G M F和T141G R配对的PCR产物电泳图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0025]所有实施例中的分子生物学操作方法为该领域技术人员所熟悉，可以参考Sambrook等“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)。
[0026]实施例一
以人类男性不育症基因致病位点T141G所在的基因的第2外显子DNA序列为模板，利用软件primer premier 5.0设计引物。
[0027]检测T141G突变位点的引物的碱基序列:
正常模板配对引物T141G N F:5’-TCCGAGAAGGAGCTG-3’ ；突变模板配对引物T141G ΜF:5’_ TCCGAGAAGGAGCGG-3’ ；共同的下游引物 T141G R:5’ -AGGCTGAGGCAGGAG-3’。其中，所述正常模板配对引物T141G N F和突变模板配对引物T141G M F的3’端的-3与-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰，或将_2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。
[0028]实施例二
取受检患者血液样品，提取DNA后，才用引物试剂盒使用流程操作。PCR产物用凝胶电泳系统进行鉴定，根据电泳条带的有无来判断基因T141G突变位点的基因型。具体判断方法如下:
1，当突变模板配对弓I物与下游引物组成的一对弓I物对未知的DNA模板进行PCR扩增，如果观察到目的电泳条带则表明该未知DNA模板在相应的检测位点含有突变型基因。
[0029]2，当正常模板配对引物与下游引物组成的一对引物对未知的DNA模板进行PCR扩增，如果观察到目的电泳条带则表明该未知DNA模板在相应的检测位点含有正常型基因。
[0030]3，当上述两对引物都对未知DNA模板进行扩增并通过电泳观察到目的条带，则表明该检测位点为杂合型。
[0031]PCR扩增结果如附图1所示。根据PCR产物电泳条带状况判断，样品1的基因中T141G位点为正常纯合；样品2的基因型为突变纯合；样品3的基因型为杂合。将该片段送测序，测序结果印证了 PCR检测结果正确。由此判断，样品1的携带者患有遗传病男性不育症的几率很低；样品2的携带者患有遗传性男性不育症的几率极高。
【主权项】
1.一种检测人类男性不育症致病基因突变的PCR试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括检测男性不育症Galntl5基因中1个致病突变位点G323A的一组特异性引物中及PCR反应 mix。2.根据权利要求1，以男性不育症Galntl5基因致病位点G323A所在的Galntl5基因的第2外显子DNA序列为模板设计引物，其特征在于:针对致病位点G323A所设计的引物对中，正常模板配对引物中上游引物的3’端含有序列AGTAGA，突变模板配对引物中上游引物的3’端含有序列AGTAAA ;其中3’端的-3与-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰，或将_2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。3.根据权利要求2，优选的一组特异性引物的序列分别如下所示: 正常模板配对引物G323A N F:5’ -GTGATTATCAGTAGA-3’ ；突变模板配对引物G323A ΜF:5’ - GTGATTATCAGTAAA-3’；共同的下游引物 G323A R:5’ -AACACATTTTGTGCC-3’；其中，所述正常模板配对引物G323A N F和突变模板配对引物G323A M F的3’端的-3与-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰，或将_2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。4.根据权利要求3，所述正常模板配对引物及突变模板配对引物的3’端的-3与-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰，或将_2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。5.一种采用权利要求1和2检测人类男性不育症Galntl5基因中1个致病突变位点G323A的PCR扩增方法，其特征在于:PCR扩增由预变性和30-40次扩增温度循环组成，循环条件为95 °C预变性10 min，94 °C变性30 sec, 55 °C退火30 sec, 72 °C延伸30 sec，循环30-40次，循环结束后72 1:补齐延伸10 min后反应结束。
【专利摘要】本发明公开了一种检测男性不育症Galntl5基因中1个致病突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法。其方法特点是经耐3’-5’外切酶酶切修饰的突变检测引物在高保真DNA聚合酶参与的PCR反应中，从而提高PCR的特异性，可直接观察凝胶电泳的产物条带的有无来判断Galntl5基因相应突变位点的基因型。本检测试剂盒对仪器设备要求低，操作简单，经济，无需测序，一般分子生物学实验室即可操作。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105316394
【申请号】CN201410360111
【发明人】朱威, 贺雄雷, 郭蕾, 雷楗勇, 潘武广
【申请人】广州君赫生物科技有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年7月28日