一种抑制玉米霜霉病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系， 更具体的说，是探索化合物对玉米霜霉病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002]玉米霜霉病是一种毁灭性的系统侵染病害，主要发生在热带、亚热带的玉米种植 区，可引起热带低地和亚热带中炜度高地的玉米产量损失达30~60%。
[0003]玉米霜霉病菌在玉米上可引起系统症状。其表现除指疫霉菌使叶片发生斑驳、叶 脉不规则增厚、花序多育、雄穗畸形呈刺猥状等所谓"疯顶"的特别症状外，其余霜霉菌所致 症状基本相似。玉米由苗期到成株期都可发病，苗期生长缓慢，节间缩短，植株矮化，重病株 不能正常抽穗，或果穗与雄花畸形。叶片上出现淡绿色、淡黄色、苍白色或紫红色的条纹或 条斑，宽度不等，多与叶脉平行，以后变褐枯死。湿度高时在叶背面或两面产生形成灰白色 霉层。局部侵染的叶片形成近圆形褪绿斑，或形成短而窄的褪绿条斑、条纹，后期连接成不 规则的长条斑，叶片变黄褐色干枯。
[0004]玉米霜霉菌是一种专性寄生菌，以种子内潜伏的菌丝体、杂草寄主上的孢子囊和 病株残体及土壤中的卵孢子越冬，成为生长期玉米发病的初侵染来源。种子带菌部位包括 种皮、胚芽、胚乳和盾片，但带菌种子只有在保持一定的含水量时，病菌才能存活，并通过种 子引起病害。在田间，玉米霜霉病主要通过两种途径传播：玉米或其它寄主发病植株上产生 的游动孢子通过风雨在植株间传播；存在于田间植株病残体中的卵孢子在次年条件适宜时 萌发，形成侵染源。
[0005]玉米霜霉病菌以土壤中或植物残体上的卵孢子或菌丝体以及杂草寄主上的游动 孢子囊越冬，卵孢子经过两个生长季仍有致病力，在干燥条件下能保持发芽力长达14年。 病菌的卵孢子是远距离传播的重要方式。在病区不仅病株残体和遗落在土壤中的卵孢子是 重要侵染源，而且卵孢子可以随玉米材料包装物远距离传播，在热带和亚热带，一些杂草性 寄主，如约翰逊草、假约翰逊草、假高粱等周年存活，在这些寄主上发病产生的孢子囊也是 不容忽视的重要初侵染来源。
[0006] 病菌常以游动孢子囊萌发形成芽管或以菌丝从气孔侵入玉米叶片，在叶肉细胞间 扩展，经叶鞘进入茎杆，在茎端寄生，再发展到嫩叶上。生长季病株上产生游动孢子囊借风 雨传播引起再侵染和流行。高湿尤其是降雨和结露是病害发生的决定性因素，相对湿度85% 以上，夜间结露或有降雨发生有利于游动饱子囊的形成、萌发和侵染，研究表明病菌产生分 生孢子最适温度为20~24°C。玉米出苗一个月内易感病，种植密度大，通风透光不良，株间 湿度高发病重，此外连作造成病菌积累也导致发病重。
【发明内容】
[0007] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对玉米霜霉病菌的生物活性。
[0008] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对玉米霜霉病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量得到 其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0009] 所述化合物结构特征如下式所示：
【具体实施方式】
[0010] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。
[0011] 实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0012] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0013] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0014] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为24°C。
[0015] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50μL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为24°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0016] 计算公式为：菌液浓度=nX20X100cfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0017] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0018] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、124和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于24°C培养24h，以肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。
[0019] 测得最小抑菌浓度MIC值为16μg/mL。
[0020] 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0021] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0022] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0023] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为24°C。
[0024] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50μL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为24°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20X100cfu/mL。
[0025] (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0026] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10μL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0027] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、124和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为l~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于24°C培养24h，以肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10μL接种于营养琼脂平板上，做好标记，于24°C培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复三次。
[0028] 测得最小杀菌浓度MBC值为64μg/mL。
【主权项】
1. 一种抑制玉米霜霉病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下式所示：(2) 其可作为玉米霜霉病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对玉米霜霉病菌的最小抑菌浓度MIC值为16 μ g/mL ; (4) 其对玉米霜霉病菌的最小杀菌浓度MBC值为64 μ g/mL。
【专利摘要】本发明发现对玉米霜霉病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其玉米霜霉病菌的最小抑菌浓度MIC值为16μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为64μg/mL。
【IPC分类】A01P3/00, C07D413/04
【公开号】CN105330656
【申请号】CN201510729940
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月2日