一种从酵母中提取虾青素、酵母抽提物和葡聚糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于天然产物的提取开发，特别涉及一种从酵母中提取虾青素、酵母抽提物和葡聚糖的方法。
【背景技术】
[0002]红法夫酵母(Phaffia rhodozym)，一种能够合成多种类胡萝卜素的专性耗氧微生物。野生红法夫酵母能产10多种类胡萝卜素，其中主要是虾青素。因而，红法夫酵母是目前微生物发酵生产虾青素普遍采用的菌株。但是由于目前生物法制备虾青素的产量均较低，生产成本高，导致经济效益低。因此，亟需寻找一种全面开发红法夫酵母的方法，来生产高附加值产物，增加经济效益，降低生产成本，使红法夫酵母更好的工业化应用。由于该种酵母的总氮含量48.2 %，蛋白质含量30.1 %，总糖含量40.3 %，因此可以作为制备酵母抽提物和葡聚糖的优良原料，使红法夫酵母更为充分的被开发利用，进一步增加经济效益，为工业化应用奠定基础。
[0003]虾青素(Astaxanthin，3, 3_ 二羟基_4，4_ 二酮基-β，β -胡萝卜素)，分子式C40H5204,相对分子量596.86，不溶于水，具脂溶性，是一种菇烯类不饱和化合物，广泛存在于生物界中，特别是水产动物的虾、蟹、鱼和鸟类的羽毛中。由于虾青素分子结构中的共扼双键，以及共扼双键末端的不饱和酮基和羟基，能吸引自由基从而具有极强的抗氧化作用，其还具有抗肿瘤、降血脂、延缓衰老等功能，同时作为脂溶性的鲜红色色素，在食品，医药，化妆品以及水产养殖业等方面有着广阔的应用前景。
[0004]酵母抽提物(Yeast extract)，是一种天然、营养、健康的酵母深加工食品配料，由各种营养价值较高有效成分组成，包括蛋白质降解后生成的多肽和氨基酸、核酸降解后生成的核苷酸以及B族维生素、微量元素等，广泛应用于食品或保健品行业。葡聚糖(Glucan)是从酵母细胞壁中提取的一种葡萄糖聚合物，因其具有增强免疫功能的能力，被誉为是生物效应应答剂，广泛应用于食品、医药以及饲料加工行业。
[0005]虾青素作为红法夫酵母的主要产物，属于胞内产物，因此需要将酵母破壁，使虾青素能够被提取出来。但是酵母抽提物大部分属于酵母内溶物，在制备虾青素的过程中应该尽量防止内溶物渗漏。目前常用的破壁方法有两类，一种酶法破壁，一种物理化学破壁(如超声破壁、高温高压破壁、酸热法破壁和碱热法破壁等)。现有的破壁方法都是以最大限度的破碎酵母细胞壁为目的，这些方法极大程度地破坏红法夫酵母细胞壁的结构，可能会改变虾青素的结构影响虾青素的制备，同时彻底破壁会使得酵母的内溶物被释放出来，从而影响酵母抽提物以及改变葡聚糖的结构。因此需要寻找一种方法能保证虾青素的最大提取率的同时防止细胞内溶物的释放，使得能够同时得到虾青素、酵母抽提物和葡聚糖三种高附加值产物。
[0006]目前，用于虾青素提取的方法主要有溶剂浸提法和超临界二氧化碳萃取法。溶剂浸提法中主要采用有机溶剂(如:乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮等)进行浸提。但这些溶剂大部分是有毒试剂，并且价格较高，在生产过程中及产品中都存在安全隐患，不利于产品的工业化生产和应用。超临界二氧化碳萃取虽能有效地提取虾青素并最大限度地避免其降解，但对设备的要求很高，价格昂贵，且二氧化碳用量大，提取物中虾青素含量较低，阻碍了其大规模工业生产。
[0007]尚无文章报道利用同一酵母菌种同时高效生产多种产品(即虾青素、酵母抽提物和葡聚糖)以及有效地从酵母中提取虾青素以及制备酵母抽提物和葡聚糖的工艺。
【发明内容】
[0008]由于目前红法夫酵母的虾青素产量均较低，致使虾青素的生产成本高，因此需要寻找一种方法来全面开发红法夫酵母，来生产高附加值产物，增加经济效益，降低生产成本。本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种从酵母中提取虾青素、酵母抽提物和葡聚糖的方法。该方法高效快速温和。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种从酵母中提取虾青素、酵母抽提物和葡聚糖的方法，包括如下步骤:
[0010](1)细胞的预处理:称取酵母菌体，按一定固液比配成酵母菌悬液，添加一定量纤维素酶，混勾，调节pH值为4?5，于45?55°C下酶解反应4?12h ;反应结束后，灭酶活，固液分离，取沉淀，将沉淀洗净，得到预处理的酵母菌体；
[0011](2)虾青素提取:在步骤(1)得到的预处理的酵母菌体中添加有机溶剂，避光振荡提取，固液分离，液体即为虾青素溶液，固体用于制备酵母抽提物；
[0012](3)酵母抽提物的制备:将水和步骤(2)得到的固体混匀后，接着加入酵母抽提酶和无机盐，于55°C反应，反应结束后灭酶活，固液分离，液体干燥后即为酵母抽提物，固体用于制备葡聚糖；
[0013](4)葡聚糖制备:将碱液和步骤(3)得到的固体混匀，反应，固液分离，将固体洗净并干燥，即得到酵母葡聚糖。
[0014]步骤(1)中所述的酵母菌体为经过干燥处理的酵母菌体或者湿的酵母菌体。
[0015]所述的酵母为红法夫酵母。
[0016]所述的红法夫酵母优选为红法夫酵母As 2.1557菌株或红法夫酵母ATCC66270菌株。
[0017]步骤(1)中所述的酶解反应的体系优选为每100mL反应体系中含10?20g酵母菌体和0.5?10mL纤维素酶溶液；更优选为每100mL反应体系中含10?20g酵母菌体和4?10mL纤维素酶溶液；最优选为每100mL反应体系中含10g酵母湿菌体和6mL纤维素酶溶液。
[0018]步骤(1)中所述的纤维素酶溶液为纤维素酶粗酶液。
[0019]步骤(1)中所述的纤维素酶溶液优选为丹麦诺维信的Celluclast 1.5L纤维素酶。
[0020]步骤(1)中所述的pH值优选为通过盐酸调节；更优选为通过浓度为3M的盐酸调
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[0021]步骤(1)中所述的酶解反应的温度优选为50°C。
[0022]步骤(2)中所述的有机溶剂优选为食用乙醇。
[0023]步骤(2)中所述的有机溶剂的用量优选为按每g酵母干菌体配比40?80mL有机溶剂计算；更优选为按每g酵母干菌体配比60mL有机溶剂计算。
[0024]步骤(2)中所述的提取的时间优选为20?90min ;更优选为60?70min。
[0025]步骤(3)中所述的水优选为去离子水或超纯水。
[0026]步骤(3)中所述的水的用量优选为按每10g步骤⑵得到的固体配比100ml水计笪弁ο
[0027]步骤(3)中所述的酵母抽提酶的添加量优选为按每g酵母干菌体配比0.01?
0.03g酵母抽提酶计算。
[0028]步骤(3)中所述的无机盐优选为氯化钾。
[0029]步骤(3)中所述的无机盐的添加量优选为按每g酵母干菌体配比0.01?0.03g无机盐计算。
[0030]步骤(3)和步骤(4)中所述的干燥的方式包括冷冻干燥、喷雾干燥或者旋转蒸发干燥。
[0031]步骤(4)中所述的碱液优选为氢氧化钠溶液；更优选为浓度为质量百分比2-6%的氢氧化钠溶液。
[0032]步骤⑷中所述的碱液的用量按每12.5?50g步骤(3)得到的固体配比100ml碱液计算。
[0033]步骤⑷中所述的反应的条件优选为45?75°C反应1?3h。
[0034]本发明中所述的固液分离的方法为离心法或者过滤法。
[0035]本发明中所述的灭酶活的条件优选为于95?100°C处理3?5min。
[0036]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0037](1)红法夫酵母具有生长速率快，发酵周期短，虾青素含量高，菌体可直接用做饲料等优点，是虾青素生产的首选微生物；但是目前生物法制备虾青素的产量均较低，生产成本高，因此需要更为全面的开发红法夫酵母，增加其经济效益。该菌株含有较高的蛋白和多糖，可以被用来制备酵母抽提物和葡聚糖，从而增加经济效益，降低生产成本。由于目前的破壁方法都是以彻底破壁为前提，一些复杂而激烈的方法会严重影响了虾青素的高效提取以及虾青素结构的完整；同时彻底破壁使得细胞完整性破坏，细胞内溶物渗透，影响后续酵母抽提物的制备。目前所用的方法提取效率低，耗时长，虾青素纯度低，生产成本高，存在安全隐患等，无法满足工业化的要求。因此需要寻找快速高效提取虾青素，并且生产高附加值副产物，从而提高经济效益，更好地实现工业化。本发明通过利用纤维素酶粗酶液处理红法夫酵母，改变酵母细胞壁的通透性保证细胞的完整性，用食用乙醇提取虾青素，通过酵母抽提酶酶解提取色素后的红法夫酵母来制备酵母抽提物，将剩余的酵母残渣通过碱处理得到葡聚糖。本发明的方法不仅适用于干菌体，还适用于湿菌体，无需对酵母进行干燥从而降低生产成本；耗时短，条件温和；虾青素提取率高，同时能够获得酵母提取物和葡聚糖等多种产物，从而提高了红法夫酵母的利用价值，增加经济效益，为工业化生产奠定坚实基础。
[0038](2)本发明主要侧重于对红法夫酵母的全面开发利用，在制备虾青素的同时制备酵母抽提物和葡聚糖，首次制备红法夫酵母的酵母抽提物和葡聚糖，作为虾青素的副产物，进一步增加工业化生产的经济效益。本发明通过纤维素酶处理红法夫酵母，改变细胞壁的通透性，使虾青素能够渗透出来，同时保证细胞的完整性，保留细胞的内源物质，有利于后期酵母抽提物的制备。
[0039](3)本发明所用的纤维素酶溶液为粗酶液，易于获得，并且价格低，生产成本较低；条件更温和，对虾青素的破坏极少