原生藻菌的转化方法_3

化 方法可w适用，也可w列举将重组表达载体导入细胞的转化方法。对于本发明中向原生藻 菌中的导入去饱和酶基因的详细说明具体记载于实施例中。再者，作为转化对象的原生藻 菌没有特别地限定，如前所述，可W作为优选的例子列举出网粘菌类。
[0137] 作为表达的载体没有特别地限定，可W列举出插入基因的重组表达载体。在重组 表达载体的制备中，可W使用质粒、隧菌体、或者粘粒等，但是没有特别地限定。再者，制备 方法也可W使用公知的方法。载体的具体种类没有特别地限定，可W适当选择在宿主细胞 中能够表达的载体。也就是说，根据宿主细胞的种类，为了确定地使基因被表达而选择适当 的启动子序列，作为表达载体可W使用将该启动子序列与本发明的基因组合入各种质粒等 的物质。表达载体中优选至少含有一个选择标记。作为运样的标记，对于真核生物细胞的 培养，可W列举出二氨叶酸还原酶或者耐新霉素基因、GFP等。借鉴抗生素感受性的结果和 真核生物转化体系中使用的选择标记基因，表明在网粘菌类的转化体系中能够使用的选择 标记基因为W下表1中所示的物质有效。
[0138] 如果使用上述的选择标记，能够确认本发明相关的聚核巧酸是否导入进宿主细 胞，进一步地其在宿主细胞中是否确实地表达了。或者，可W将本发明相关的脂肪酸不饱和 化酶作为融合多肤表达，例如，可W将维多利亚多管发光水母(AequoreaVictoria)来源的 绿色巧光多肤GFP作为标记使用，使本发明相关的脂肪酸不饱和化酶作为GFP融合多肤表 达。
[0139] 优选通过电穿孔或基因枪法导入外源基因，关于具体的导入条件如表2所示。在 本发明中，通过导入脂肪酸不饱和化酶基因，与导入脂肪酸不饱和化酶基因前相比较，细胞 的脂肪酸组成发生变化。目P，通过表达脂肪酸不饱和酶化基因，能够得到脂肪酸组成的改变 的效果。
[0140] 通过原生藻菌的转化，能够得到改变产生的脂肪酸组成的原生藻菌（微生物）。编 码该脂肪酸不饱和化酶的基因被能够表达地导入原生藻菌，例如，能够在不饱和脂肪酸的 制造中利用。在不饱和脂肪酸的制造中，可W使用上述产生的脂肪酸组成被改变的原生藻 菌，对于其它的工序、制造设备、器具等的各种条件没有特别地限定。在不饱和脂肪酸的制 造中，包含培养通过上述的改变方法产生的脂肪酸组成被改变的微生物的工序，利用微生 物和其它的培养基，制造不饱和脂肪酸。 阳141] 上述细胞的培养条件（培养基、培养溫度、通气状态等）能够根据细胞的种类、目 标不饱和脂肪酸的种类、它们的量等适当的设定。
[0142] 此外，本发明所述不饱和脂肪酸也指含有不饱和脂肪酸的物质，其含量、纯度、形 状、组成等没有特别地限定。目P，在本发明中，脂肪酸组成被改变的细胞或其培养基本身也 可视为不饱和脂肪酸。再者，可W进一步包含从该细胞或培养基纯化不饱和脂肪酸的工序。 作为纯化不饱和脂肪酸的方法，可W适用作为W不饱和脂肪酸起始的脂质（含有复合脂 质）的纯化方法的公知方法。 阳143][使原生藻菌大量蓄积不饱和脂肪酸的方法]
[0144] 通过培养转化的本发明的原生藻菌达到使原生藻菌蓄积不饱和脂肪酸。例如，用 通常可W使用的固体培养基或液体培养基等培养。运时，作为可W使用的培养基，例如，作 为碳源的葡萄糖、果糖、薦糖、淀粉、甘油等，W及作为氮源的酵母提取物、玉米浆、多聚蛋白 腺、谷氨酸钢、尿素、醋酸锭、硫酸锭、硝酸锭、氯化锭、硝酸钢等，W及作为无机盐的憐酸钟 等，适当组合其它必要成分的培养基，只要是为了培养网粘菌类通常可w使用的物质，并没 有特别地限定，但是特别优选的是使用酵母提取物?葡萄糖琼脂培养基（GY培养基）。制备 培养基后，将抑调节至3. 0~8. 0的范围内后，通过高压灭菌锅杀菌使用。培养可W在W 下条件中进行：10~4(TC，优选15~35Γ，1~14天，通气揽拌培养、振荡培养、或静置培 养。
[0145]回收产生的不饱和脂肪酸是，在培养基中生长原生藻菌，处理从该培养基得到的 微生物细胞，使其释放细胞内脂质（含有多不饱和脂肪酸的油脂含有物或多不饱和脂肪 酸），从含有该被释放的细胞内脂质的培养基回收脂质。目P，将运样培养的原生藻菌通过离 屯、分离等回收，破坏细胞，按照规定使用适当的有机溶剂提取出细胞内的脂肪酸，通过W上 方法能够得到多不饱和脂肪酸含有比例增加的油脂。 阳146] 本发明通过培养导入脂肪酸不饱和化酶的转化的原生藻菌，改变原生藻菌产生的 脂肪酸的组成，但是运是经将原生藻菌通常产生的脂肪酸通过被导入的脂肪酸不饱和化酶 基因不饱和化实现的。改变前后的脂肪酸组成的变化在表8至表10中对比表示。例如，通 过粉核油球藻（Pinguio地yceae)来源的Δ12去饱和酶的表达生成的脂肪酸的种类没有变 化，但是导入的酶对生成比例产生了影响。特别地，发生从油酸向亚油酸的转化，其转化效 率达到30 + 6. 6%。 阳147] 其次，在有的种类的网粘菌中，根据异种网粘菌来源的Δ5去饱和酶的表达试验， EPA的含有比例上升了 1. 4倍左右。用含有ETA或DGLA的培养基培养时，ETA和DGLA各自 被转化为EPA和AA，增加了不饱和脂肪酸。网粘菌内的转化效率是，网粘菌内的前体物质的 转化效率较酵母的情况高，ETA是75%，DGLA是63%。运些结果是从CG-MS的试验数据得 到的。
[0148] 再者，本发明的不饱和脂肪酸被包含在各种医药品、食品、或者工业制品中，其使 用领域没有特别地限定。而且，在含有具有本发明不饱和脂肪酸的油脂的食品中，包括补充 剂等的健康食品、食品添加剂等。另外，作为工业制品，可W举例W人W外的生物为对象的 饲料、薄膜、生物分解性塑料、功能性纤维、润滑油、洗剂等。
[0149] 下面，基于本发明的实施例具体说明本发明，但是本发明并非根据W下的实施例 有任何的限定。 阳150]实施例1 阳151][网粘菌类及其培养方法?保存方法] 阳巧2] (1)本发明使用的菌株
[0153] 金黄色破囊壶菌灯虹austochytriumaureum)ATCC34304、和破囊壶菌 (Thraustochytriumsp.)ATCC26185 获自ATCC。Aurantiochytriumlimacinummh0186、 和裂殖壶菌（Schizochytriumsp. )ALlAc获自宫崎大学农学部。
[0154]再者，裂壶藻（Schizochytriumaggregatum)ATCC28209、和吾肯氏壶菌 〇J化enia sp. )ATCC28207 获自ATCC。裂殖壶菌（Schizochytriumsp. )S邸210(NBRC102615)、裂殖壶 菌（Schizochytriumsp.)S邸:345(NBRC102616)、Bot;ryochyt;riumradia1:umS邸353(NBRC 104107)、和Pa;rietich5ftiumsarkarianum沈K364 获自甲南大学理工学部。
[0155] 似培养基的组成
[0156] i.琼脂培养基的组成 阳157]PDA琼脂平板培养基
[0158]将0.78% (w/v) ±豆右旋糖琼脂培养基（日水制药公司制）、1. 75% (w/v)海洋生 物（sealife)(MarineTech公司制）、1. 21% (w/v)琼脂粉末（化calaiTesque公司制） 混合，于12rC进行高压灭菌锅灭菌20分钟。充分冷却后，为了防止细菌污染，加入氨节青 霉素酸钢（化calaiTesque公司制），使其最终浓度为100μg/ml，分配于培养皿中，在平的 处所静置使其固化。 阳159]ii.液体培养基的组成[0160]GY液体培养基 阳161] 将3. 18% (w/v)葡萄糖WacalaiTesque公司制）、1. 06% (w/v)干燥酵母提取物 (化calaiTesque公司制）、1.75% (w/v)海洋生物（MarineTech公司制）、混合，于12TC 高压灭菌锅灭菌20分钟后，添加100μg/ml氨节青霉素酸纳（化calaiTesque公司制）。 阳162]PD液体培养基
[0163]将 0. 48 % (w/v) ±豆右旋糖值ifco公司制）、1. 75 % (w/v)海洋生物（Marine Tech公司制）混合，于12rC高压灭菌锅灭菌20分钟后，添加100μg/ml氨节青霉素酸纳 (NacalaiTesque公司审ij)。 阳164]Η液体培养基 阳1化]将0. 2% (w/v)葡萄糖WacalaiTesque公司制）、0. 02% (w/v)干燥酵母提取物 (化calaiTesque公司制）、0. 05%谷氨酸钢（化calaiTesque公司制）、1.75% (w/v)海洋 生物（MarineTech公司制）混合，于12TC高压灭菌锅灭菌20分钟后，添加100μg/ml氨 节青霉素酸纳（化calaiTesque公司制）。 阳166] 0)培养方法
[0167] i.琼脂平板培养
[0168] 使用接种环或涂布器接种网粘菌菌体，经25°C静置培养使其出现菌落。关于其次 代培养，用接种环取出菌落悬浮于灭菌生理盐水后，使用接种环或涂布器将所得悬浮液涂 布进行次代培养。并且，根据需要通过将平板上的菌体接种于液体培养基进行向液体培养 基的转换。 阳1例ii.液体培养
[0170] 接种网粘菌菌体，使用锥形瓶或试管于25°CW15化pm的转速边揽拌边进行悬浮 培养。关于其次代培养，W相对于新的GY或PD液体培养基的1/200~1/10的容积加入确 认增殖的对数增殖期至稳定期的培养液进行次代培养。并且，根据需要通过将细胞培养液 涂布于PDA琼脂平板培养基中进行向琼脂平板培养的转换。 阳171] (4)网粘菌类的保持?保存方法
[0172] 通过加入至次代培养中，制备甘油储藏液进行冰冻胆藏。目P，向使用GY液体培 养基的对数增殖期至稳定期的细胞悬浮液，添加最终浓度为15% (v/v)的甘油（化calai Tesque公司制），在-80°C的深冷冰箱中保存。 阳173]实施例2
[0174][在网粘菌类的抗生素感受性试验和转化体系中使用的选择标记的选择]
[01巧](1)经液体培养显示感受性的抗生素的筛选 阳176]网粘菌类4株的预培养液添加含有各种抗生素的GY液体培养基，W150rpm、25°C 培养5天后于600皿处测定其浊度（0D600)。使用的抗生素和浓度、W及其结果如图1所 /J、- 〇 阳177] 似在液体培养中的最小抑菌浓度（MIC)的确定
[0178] 关于显示感受性的抗生素，在液体培养中进行MIC的确定。向含有各种浓度的各 种抗生素的GY液体培养基中加入网粘菌类4株的预培养液，于15化pm、25°C培养5天后， 于600nm处测定浊度（0D600)。金黄色破囊壶菌化aureum)的结果如图2所示，破囊壶菌 (T虹austochytriumsp.)ATCC26185 的结果如图 3 所不，A.limacinummh0186 的结果如图 4所示，裂殖壶菌（Schizochytriumsp. )ALlAc的结果如图5所示。 阳179] (3)在琼脂平板培养中的MIC的确定
[0180] 将网粘菌类4株的预培养液5μ1滴入至含有各种浓度的各种抗生素的PDA琼脂 平板培养基中，于25°C培养7天后，观察菌落的形成。金黄色破囊壶菌化aureum)的结果如 图6所示，破囊壶菌灯虹austoch}ft;riumsp.)ATCC26185的结果如图7所示，A.limacinum mh0186的结果如图8所示，裂殖壶菌（Schizochytriumsp. )ALlAc的结果如图9所示。 阳181] 借鉴在运些结果、抗生素耐受性的结果和真核生物转化体系中可W使用的选择标 记基因，显示在网粘菌类的转化体系中可W使用的选择标记基因是W下表1中所示的物质 有效。
[0182][表U阳 183]
阳184] 化…耐新霉素基因Hygt…耐潮霉素基因 阳化5] Blat…耐杀稻攝菌素基因Blet…耐博来霉素基因 阳186] 实施例3 阳187][金黄色破囊壶菌化aureum)来源的EF-1α和泛素基因的分离，W及它们的基因 表达调控区域的分离]
[0188] (1)金黄色破囊壶菌化aureum)来源的EF-1α基因和基因表达调控区域的分离
[0189] i.金黄色破囊壶菌化aureum)来源的EF-1α基因cDNA序列的分离
[0190] 通过将GY液体培养基培养的金黄色破囊壶菌化aureum)的对数增殖期至稳定期 的菌体于4°C、3500xg离屯、10分钟收集细菌。将得到的菌体悬浮于灭菌生理盐水中后通过 再次进行离屯、操作洗涂菌体，经液氮迅速冷冻后于乳鉢中将其捣碎直至成粉末状。然后，使 用Scpaso!wRNAISuper(化calaiTesque公司制）从细胞破碎液提取总RNA。然后，使用 01igotex?-dT30<Supe;r〉mRNA纯化试剂盒（TakaraBio公司制）进行从总RNA至mRNA的 纯化。
[0191]接着，使用SMARTTmRACEcDNA扩增试剂盒（clontech公司制）制备在5'和3'末端 添加合成接头的cDNA库。并且，基于已知的EF-la的保守序列，使用DNA合成器（Applied Biosystems公司制）制备一个正向的简并寡核巧酸引物EF-F1 (序列表序列号1)。使用运 些进行3'RACE时，特异性扩增产物被确认。于是，用干净的刀等将经1 %琼脂糖凝胶电泳分 离的该DNA片段切割出，按照非专利文献10中记载的方法从琼脂糖凝胶中提取出DNA。然 后，使用pGEMR-TeasyVectorSystemUPromega公司制）进行该DNA片段的TA克隆，根 据Sanger等的方法（非专利文献11)确定它们的碱基序列。具体地说，通过使用Bi曲yeR Terminatorv3.1 切eleSequencingKit和 3130 基因分析器（AppliedBiosystems公司 制），通过染料标记的终止法进行碱基序列的确定。其结果，由于得到的98化p的3'RACE 产物（序列表序列号2)显示与其它生物来源的EF-la基因的高度同源性，因此强烈提示 其为金黄色破囊壶菌化aureum)来源的EF-la基因的部分序列。 阳19引因此，基于得到的序列制备2个反向的寡核巧酸引物EF-1H序列表序列号3)和EF-2H序列表序列号4)，使用它们进行5'RACE。其结果，两者中各自特异性的5'RACE产 物被确认。碱基序列分析的结果，由前者是由49化P(序列表序列号5)、后者是由43化P(序 列表序列号6)形成的金黄色破囊壶菌化aureum)来源的推测EF-1α基因的部分序列。关 于任何一方的重复部分，可知与3'RACE产物完全一致。
[0193] 从W上的结果显示，本次得到的金黄色破囊壶菌化aureum)来源的推测EF-1α 基因的cDNA序列是139化Ρ(序列表序列号7)，其中关于0RF区域是编码341个氨基酸残基 (序列表序列号8)的1023bp(序列表序列号9)。 阳194]ii.金黄色破囊壶菌化aureum)来源的EF-1α基因的基因调控区域的分离 阳1巧]通过将GY培养基培养的金黄色破囊壶菌化aureum)菌体离屯、收集菌体。通过将 得到的菌体悬浮于灭菌生理盐水后进行再次离屯、操作洗涂菌体，用液氮急速冷冻后于乳鉢 中捣碎直至成粉末状。然后，按照非专利文献12中记载的方法提取出基因组DNA，通过测定 A260/280进行提取出的基因组DNA的纯度和浓度的测定。
[0196] 然后，使用体外LAPCR克隆试剂盒，通过PCR基因组步移法尝试EF-1α基因0RF 上游序列（启动子）、或0RF下游序列（终止子）的分离。并且，在0RF上游序列的扩增中 使用的反向寡核巧酸引物是r3(序列表序列号10)，在0RF下游序列的扩增中使用的正向 寡核巧酸引物是EF-t-Fl(序列表序列号11)和EF-t-F2(序列表序列号12)。在分析可W 得到的特异性扩增产物的碱基序列时，可知在615bp的金黄色破囊壶菌化aureum)来源的 EF-1α基因0RF上游序列（序列表序列号13)，和1414bp的0RF下游序列（序列表序列号 14)的分离中取得成功。W下，前者记为EF-la启动子，后者记为EF-la终止子。
[0197] 似金黄色破囊壶菌化aureum)来源的泛素基因和基因表达区域的分离 阳198]i.金黄色破囊壶菌化aureum)来源的泛素基因cDNA序列的分离 阳 199]W使用SMARTTmRACEcDNAAmplificationKit(clontech公司制）制备的cDNA库 作为模板，进行使用基于已知的泛素基因的保守序列制备的正向简并寡核巧酸引物2F(序 列表序列号15)的3'RACE。在分析得到的扩增产物的碱基序列时，可知其为278bp(序列表 序列号16)的金黄色破囊壶菌化aureum)来源的推测泛素基因的部分序列。关于5'RACE， 尽管尝试各种寡核巧酸引物的使用和PCR条件，也不能得到特异性扩增产物。由此，怀疑高 GC含量来源的目标RNA的高级结构阻碍cDNA库制备时的逆转录反应的可能性。
[0200]因此，使用具有热稳定性高的逆转录酶的5'RACESystemforRapid AmplificationofcDNAEnds,第 2 版，（Invitrogen公司制）进行 5'RACE。并且，在逆转 录反应中使用的反向寡核巧酸引物，和cDNA合成后的PCR反应中使用的反向寡核巧酸引物 分别是1R(序列表序列号17)和2R(序列表序列号18)。在分析得到的扩增产物的碱基序 列时，其为26化p(序列表序列号19)的金黄色破囊壶菌化aureum)来源的推测泛素基因 的部分序列，与3'RACE产物的重复部分完全一致。从W上的结果可知在金黄色破囊壶菌 (T.aureum)来源的推测泛素基因的cDNA序列的分离中取得成功。 阳201] 但是，已知泛素基因一般具有同一序列的折返结构。目P，推测本次的结果并没有显 示该基因的全长结构，而是明确了构成5'、3'末端的非编码区域和0RF区域中的折返结构 的单一序列。并且，表明本次阐明的金黄色破囊壶菌化aureum)来源的泛素基因0RF区域 中的单一序列是编码76个氨基酸残基（序列表序列号20)的228bp(序列表序列号21)。 阳202] ii.金黄色破囊壶菌化aureum)来源的泛素基因的基因调控区域的分离 阳203] 使用体外LAPCR克隆试剂盒，通过PCR基因组步移法尝试泛素基因0RF上游序列 (启动子），或0RF下游序列（终止子）的分离。并且，在0RF上游序列的扩增中使用的反向 寡核巧酸引物是REVERS-UPR-U序列表序列号22)和REVERS-UPR-2(序列表序列号23)， 在0RF下游序列的扩增中使用的正向寡核巧酸引物是ubqterminalfl(序列表序列号24) 和ter2F(序列表序列号25)。在分析得到的特异性扩增产物的碱基序列时，可知在8(Ubp 的金黄色破囊壶菌化aureum)来源的泛素基因0RF上游序列（序列表序列号26)和584bp 的0RF下游序列（序列表序列号27)的分离中取得成功。W下，前者记为泛素启动子，后者 记为泛素终止子。 阳204] 该结果，在作为在网粘菌类中恒定功能的基因表达调控区域的，金黄色破囊壶菌 (T.aureum)来源的管家基因的，EF-1α和泛素基因的启动子.终止子的分离中取得成功。 阳205] 实施例4
[0206][耐药基因表达盒的制备] 阳2〇7] (1)耐新霉素基因（Ne〇t)的人工合成 阳2〇引 委托Medibikku公司，根据密码子使用数据库kodonusagedat油ase)(丽W. Kazusa.or.化/codon/)中记载的金黄色破囊壶菌化aureum)的密码子使用频率的合成人 工合成的Ne〇t。其碱基序列如序列表序列号28所示，编码的氨基酸序列如序列表序列号 29所示。
[0209] 似Ne〇t表达盒的构建
[0210]i.使用EF-1α启动子.终止子的Ne〇t表达盒的构建 阳211] 按照[日本农芸化学会志第77卷第2号（2003年2月）P150-153]记载的方法， 通过融合PCR使用序列表序列号30~38记载的寡核巧酸引物制备将金黄色破囊壶菌 化aureum)来源的18SrDNA连接于由EF-1α启动子/人工合成Ne〇VEF-lα终止子形 成的耐药基因（Ne〇t)表达盒的上游的DNA片段。并且，PCR反应条件是设定变性溫度为 98°C，时间10秒，退火及延长反应是根据引物的Tm和扩增产物的长度适当调节进行的。 阳212] 其结果，在44546口的金黄色破囊壶菌化曰脚6皿)188扣臟/邸-1〇启动子/人工 合成Ne〇VEF-lα终止子的连接中取得成功（序列表序列号39,图10)。
[0213] 然后，进行使用pGEM-Teasy(Invitrogen公司制）的ΤΑ克隆，构建具有使用作为 网粘菌用的选择标记的EF-Ια启动子.终止子的Ne〇t表达盒，和作为相同重组部位的金 黄色破囊壶菌化aureum)来源的18SrDNA序列的网粘菌-大肠杆菌穿梭载体。W下，将 其记为祀FNeomycinf(图12)。
[0214]ii.使用泛素启动子?终止子的Ne〇t表达盒的构建
[0215] 根据与使用EF-1α启动子.终止子的Ne〇t表达盒的情况相同的方法，使用序列 表序列号40~47记载的寡核巧酸引物，连接金黄色破囊壶菌化aureum) 18SrDNA/泛素 启动子/人工合成NeoV泛素终止子（图11)。利用PUC18载体的Ndel/化nl位点插入构 建的Ne〇t表达盒，构建具有使用作为网粘菌用的选择标记的泛素启动子?终止子的Ne〇t 表达盒，和作为同源重组部位的金黄色破囊壶菌化aureum)来源的18SrDNA序列的网粘 菌-大肠杆菌穿梭载体。W下，将其记为pUB化omycint(图12)。
[0216] 运些的结果，构建了具有利用作为网粘菌用选择标记的EF-1α启动子/终止子的 Νe〇t表达盒的网粘菌-大肠杆菌穿梭载体祀FNeomycint，和具有利用泛素基因的启动子/ 终止子的Ne〇t表达盒的pUBNeomycint。两种载体中，为了使得Ne〇t的网粘菌中的表达 容易，人工合成并使用在参考破囊壶菌化aureum)的密码子使用频率中最优化密码子的 Ne〇t。并且，考虑向利用相同重组的染色体DNA中的插入，具有金黄色破囊壶菌化aureum) 来源的18SrDNA序列（图10和11)。
[0217] 实施例5
[0218][向网粘菌中的基因导入实验]
[0219] (1)基因导入实验中使用的DNA
[0220] 进行使用W下所示的4种DNA的基因导入实验 阳221] (1)环状载体pUB化omycinf 阳22引（2)同pUBNeomycint 阳223] (3)基于泛素启动子·终止子的直链Ne〇t表达盒（ub-Neot)
[0224] (4)基于EF-1α启动子.终止子的直链Ne〇t表达盒巧F-Neot) 悦2引关于（3)是W下物质，WρυΒ^οηιγ(?η'为模板，使用LAtaqHotStart Version(TakaraBio公司制）、和1对寡核巧酸引物-Ubp;r〇-fug-18s-F(序列表序列号 42)/KpnterR(序列表序列号47)进行PCR，凝胶纯化得到的扩增产物而得到的物质；对于 (4)是W下物质，WpEFNeomycint为模板，使用LAtaqHotStartVersion(TakaraBio公司 制）、和1对寡核巧酸引物2F(序列表序列号32)/终止子5R(序列表序列号33)进行PCR， 凝胶纯化得到的扩增产物得到的物质。
[0226] 似在基因导入实验中使用的基因导入法 阳227]i.电穿孔法 阳228