利用乳酸产己酸的瘤胃梭菌及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种新的瘤胃梭菌Clostridiumsp.CPC-11,以 及该菌在己酸生产中的应用。
【背景技术】
[0002] 己酸（n-caproate)为含有六个碳原子的中链脂肪酸（C5HnC00H)，疏水性强，能量 密度高，是一种重要的化工原料，可用于食品香料、动物饲料、绿色抗菌剂和缓蚀剂生产等 领域。特别地，己酸是合成己酸乙酯（浓香型白酒品质的主体香味物质）的重要前体物。其 酯类产品还广泛应用于树脂、橡胶、制药等工业。
[0003] 微生物催化产己酸是一个碳链延长过程，研究最多和最为深入的是克氏梭菌 (Clostridiumklyuveri)，该菌通过乙醇氧化和逆β氧化途径的结合，以乙醇为电子供体， 乙酸为电子受体合成己酸。目前普通认为浓香白酒中己酸的产生也是以克氏梭菌为主的己 酸功能菌，通过上述途径合成己酸；进一步地，己酸与乙醇再通过酯化反应生成浓香型白酒 的主体香成份一己酸乙酯。
[0004] 理论上，乳酸类似于乙醇，也是一种还原剂，应可以为逆β氧化途径提供乙酰辅 酶Α，从而进行碳链延长合成中链脂肪酸，如己酸。但目前的研究表明，多数微生物以乳 酸为底物时，只能生成丁酸或丙酸，基本不产己酸或其他中链脂肪酸。仅有Megasphaera elsdeniiJ1据报道可以产生微量己酸（约23.2mg/L)。本领域急需开发将乳酸转化为己 酸的技术。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是现有技术难以将乳酸转化为己酸。本发明解 决技术问题的技术方案是一是提供一种瘤胃菌科（Ruminococcaceae)第4梭菌簇 (ClostridiumclusterIV)的一个新种，为Clostridiumsp.CPC-11，模式菌株的保藏号为 CGMCCNo：9926〇
[0006] 该新种的模式菌株已于2014年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮 编 100101)，保藏编号CGMCCNo:9926。
[0007] 同时，本发明提供了利用上述的瘤胃菌科细菌新种在用乳酸转化生产己酸中的用 途。
[0008] 此外，本发明还提供了上述的瘤胃菌科细菌新种在发酵酿酒中的用途。
[0009] 同时，本发明提供了上述的的瘤胃菌科细菌新种在制备人工窖泥中的用途。
[0010] 此外，本发明也还提供了上述的瘤胃菌科细菌新种在酒厂酿酒废水处理中的用 途。
[0011] 同时的，本发明也提供了一种菌剂，该菌剂包含上述的新种细菌。
[0012] 本发明也还提供了一种窖泥，该窖泥包含上述的新种细菌。同时也提供了包含上 述窖泥的窖池。
[0013] 根据本发明的第一个方面，本发明的通过前期大量研究发现，以酿酒窖池中窖泥 为接种物，可将乳酸转化为己酸，表明窖泥中存在以乳酸为底物合成己酸的功能微生物及 己酸合成的新途径。进一步通过以乳酸为唯一碳源的培养基，从窖泥中采用梯度稀释分离 获得一乳酸利用型产己酸菌。该菌为严格厌氧梭菌，能够显著地利用乳酸产生己酸。
[0014] 该菌的菌落特征：
[0015] 本发明所述菌株在上述培养基固体平板上培养5天后，菌落圆形，呈乳白色，光滑 湿润，稍凸起，较粘稠，易挑取。革兰氏染色阳性。
[0016] 该菌的生理生化特征为：革兰氏染色阳性，菌体的适宜生长温度25-35 °C， pH5. 0-7. 0。可以利用的碳源主要有：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、蜜二糖、海藻糖、半乳 糖、蜜三糖、鼠李糖、L-乳酸和D-甘露糖等（详见表1)等。不能利用的碳源主要有：乳糖、 甘露醇、木糖、阿拉伯糖、松三糖、乙酸、鼠李糖、D，L-乳酸、丙酸等（详见表1)等。
[0017] 根据形态、生理生化、16SrDNA等特征，鉴定其应为瘤胃菌科（Ruminococcaceae) 第 4 梭菌簇（ClostridiumclusterIV)的一个新种。
[0018] 根据本发明的另一个方面，由于乳酸在窖池积累影响风味，本发明获得的菌株可 应用于窖池发酵，促进乳酸转化为己酸，降低乳酸含量，增加己酸含量，从而改善与提高白 酒的风味与品质。
[0019] 同时，本发明的细菌可用于新窖池（或新窖泥）的微生物强化改良，将新窖中过高 的乳酸快速转化为己酸。因此可提高己酸，以及己酸乙酯的浓度，同时降低乳酸及乳酸乙酯 浓度过高对白酒风味的不利影响，改善白酒的风味和品质。也就是说还可以用于人工窖泥 的制备。
[0020] 根据本发明的再一个方面，该菌还可用于黄水的综合利用，即通过该菌的二次发 酵将黄水中乳酸进一步发酵转化成己酸，同时减少废水C0D排放。
[0021] 本发明的有益效果在于，提供了一种新的瘤胃菌科（Ruminococcaceae)细菌，该 菌具有高产己酸的特性及较好的生长稳定性，经扩大培养后可制备高浓度的强化产己酸菌 液，可用于利用乳酸或酿酒过程产生的黄水来发酵生产产己酸，同时可用于人工窖泥的强 化培养或窖池发酵的"增已降乳"工艺，提高己酸产量，改善白酒的风味和品质，具有很好的 应用前景。
[0022] 保藏说明
[0023]本发明涉及瘤胃菌科（Ruminococcaceae)第 4 梭菌族（ClostridiumclusterIV) 的一个新种，命名为Clostridiumsp.CPC-11。该新种的模式菌株已于2014年11月3日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCCNo:9926。
【附图说明】
[0024] 图1、细菌Clostridiumsp.CPC-11的扫描电镜照片；
[0025] 图2、细菌Clostridiumsp.CPC-11的系统发育进化树；
[0026]图3、细菌Clostridiumsp.CPC-11的黄水发酵实验结果。
【具体实施方式】
[0027] 实施例一菌种的分离、纯化与培养
[0028] 1、用于分离和培养的培养基基
[0029] 培养基组成（每100mL):lg酪蛋白胨，0· 25g酵母汁，0· 4gNaHC03, 0·lg半胱氨 酸，0· 045gK2HP04, 0· 045gKH2P04, 0· 09gNaCl, 0· 009gMgS04 ·7Η20, 0· 009gCaCl2, 0·lmg刃 天青，lmg氧化血红素，0. 5mL乳酸，微量元素溶液0.lml，维生素溶液lml。蒸馏水100ml。 其中：
[0030]微量元素溶（每L) :FeCl2. 4H20 1. 5g;CoCl2. 6H20 0· 19g;MnCl2. 4H20 0·lg; ZnCl2 0. 07g；NaM04. 2H20 0. 036g；NiCl2. 6H20 0. 024g；H3B03 0 . 006g；CuCl2. 2H20 0. 002g； HC1 (25%solution) 10ml.
[0031] 维生素溶液（每L) :p-氨基苯甲酸0· 04g;生物素0·Olg;烟酸0·lg;B5 0· 05g;B6 0· 15g办0·lg;B12 0· 05g;D.L-硫辛酸0· 03g;B2 0· 03g;叶酸0· 01g。
[0032] 2、分离过程
[0033] (1)菌种的富集
[0034] 取窖泥lg，加入上述液体培养基，除氧，在30°C下振荡厌氧培养5天后，用高效液 相色谱测定乳酸含量及代谢产物，选择乳酸明显降解的培养液转化到新鲜培养基中继续培 养、富集，经多次（5次以上）转接富集，最终以乳酸彻底降解并产生己酸的培养液为目标菌 种分离源。
[0035] (2)菌种的分离纯化
[0036] 以生理盐水，将产己酸含