专利名称：：一株高光学纯度d-乳酸生产菌及其发酵生产d-乳酸的工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株高光学纯度D-乳酸生产菌芽孢乳杆菌S/ora/acto6acz7/w";.Y2-8菌株及其发酵生产D-乳酸的工艺，属于有机酸发酵生产领域。
背景技术：
：乳酸(Lacticacid)又名a-羟基丙酸(a-Hydroxypropionicacid),是世界公认的三大有机酸之一，根据其旋光性性质可分为L-乳酸、D-乳酸和D，L-乳酸。随着D-乳酸的系列新用途的开发，对D-乳酸的应用和生产的研究也越来越受到人们的关注。目前，D-乳酸的用途主要表现在(1)D-乳酸是合成防除禾本科杂草的优良除草剂一骠马(PumaSuper)和新型广谱高效除草剂一威霸的原料，同时也是二甲四氯丙酸、氟系除草剂等新型农药的原料；(2)由高光学纯度(光学纯度97。/。以上)D-乳酸与甲醇酯化合成的D-乳酸甲酯在医药、农药、溶剂的原料及其它手性化合物的合成前体及中间体；(3)用于生产聚乳酸聚乳酸将逐步替代现有的可降解性塑料，并具有与聚烯烃类相竞争的能力。到2010年，聚乳酸年需求量将突破100万吨。乳酸经脱水环化制得丙交酯，丙交酯经开环聚合制得聚乳酸(PLA)。因为乳酸是手性分子所以相应地，所合成的聚乳酸有聚L-乳酸(PLLA)、聚D-乳酸(PDLA)及聚D，L-乳酸(PDLLA)。但是，PLLA的熔点较低及降解速度相对较慢却成了限制其进一步发展的瓶颈。最新研究显示，PLLA和PDLA的共混复合物可以将聚乳酸的熔点从177"C提髙到225°C，调整PLLA和PDLA共混复合物中不同组分的比例可调控最终材料的降解速度，这为聚乳酸的应用带来了更广阔的前景。而PDLA正是通过添加髙光学纯D-乳酸聚合制备而成的。以上产品的巨大的巿场潜力催生了髙效高光学纯D-乳酸生产研究的开展。直接利用微生物发酵法生产手性乳酸，与化学合成法、手性拆分法及酶转化法相比，发酵法不仅可通过菌种选育或代谢调控而获得光学纯度的D-乳酸，而且发酵原料来源广泛、生产成本低、可循环利用、环境友好，已成为全世界近80%的厂家生产手性乳酸采用的方法。1994年，Kosaki等人利用菊糖芽孢乳杆菌(S;ora/fl"o6fltc/〃w/""//mwATCC15538)以葡萄糖为基质发酵产D-乳酸，发酵37h后，D-乳酸的最高产量达98g/L，光学纯度达到99%;曰本达依赛尔(夕4七》)化学工业公司1997年巳拥有每年10吨光学纯度97%以上的0-乳酸生产能力；2003年，RemediosYanez和AnaBelenMoldes等人以纤维素为原料，利用丄fl"o6ac说wscoow/orw!'cw&s;.to^weraATCC25600发酵产D-乳酸，发酵时加入纤维素酶和p-葡萄糖苷酶，同时进行纤维素的糖化和D-乳酸的发酵，在39'C,pH5.4的条件下发酵48h，D-乳酸产率达到0.5g七"七-1，对纤维素产率为0.89gD-乳酸/g纤维素，但D-乳酸产量较低；2004年，G.Bustos，A.B.Moldes和J丄.Alonso等人利用响应面优化法对丄0加^"7/""00^/07^发酵生产0-乳酸的培养基进行优化，最终采用玉米浆5g/L,酵母裔3.6g/L和蛋白胨10g/L的培养基，发酵96h后得到D-乳酸58.9g/L;2006年，T.Tanak^M.Hoshina等人以脱月旨米糠(麸)为原料，禾!]用丄fl"o6a"7/twcte/6n/ecWsm6s,De/6rMec&z'IFO3202发酵产D-乳酸，发酵时加入米糠、淀粉酶、纤维素酶同时进行糖化和发酵，最终0-乳酸的质量产率可以达到对米糠28%和酶水解糖液78°/。，D-乳酸的光学纯度为95%。国内对D-乳酸生产菌和生产工艺公开和报道得较少。本研究室的丁子建等于2004首次报道利用芽孢乳杆菌(&oro/a"ok^7/^sp.)从葡萄糖发酵产D-乳酸的工艺，发酵72小时后D-乳酸产量为40.7g/L,光学纯度达96.04%，本工艺的产物光学纯度较髙，但产量相对偏低；2006年，杨文革等报道了利用乳酸杆菌采用组合发酵技术生产D-乳酸的工艺，从葡萄糖出发，发酵2538小时，产酸可达75131g/L乳酸，光学纯度达99%,但该工艺使用了组合发酵法，即发酵过程需按照有氧发酵、微氧发酵和最后的厌氧产酸发酵三步骤分阶段调控进行，搡作和控制相对困难。因此，选育高光学纯度的D-乳酸生产菌，以及开发搡作简单、产酸效率高的D-乳酸发酵工艺是D-乳酸工业的发展方向。
发明内容本发明的技术目的是提供一株优良的D-乳酸生产菌株，以及利用该菌株发酵生产D-乳酸的工艺，使得该生产菌株所产的D-乳酸具有髙光学纯度，且通过提供合适的发酵工艺条件，使得利用该生产菌株发酵生产D-乳酸的工艺不仅简单方便，而且原料易得，成本低廉，在保证产物高光学纯度的基础上达到较高的产酸能力。为实现本发明的技术目的，本发明釆取以下技术方案一、髙光学纯度D-乳酸生产菌芽孢乳杆菌&ow/a"oZ)flc///isp.Y2-8菌株1、从土壤中筛选产D-乳酸原始菌株以葡萄糖高糖液体培养基对南京地区土壤样品中的耐高糖〗敫生物进行富集培养，再通过高葡萄糖-溴甲酚绿显色平板在厌氧培养条件下对耐高糖的产酸菌株进行单离，挑选变色圈直径大且变色速度快的菌株进行产酸发酵研究，获得一株D-乳酸同型发酵菌株，命名为5^ora/a"o6ad//jDX12,超低温保藏备用。S/wratocto6flc//^DX12经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定，表明该菌株与芽孢乳杆菌S/7ora/"cto6a"7/w相似度(SIM)为0.60,经16SrDNA序列分析表明与该序列相似度高于99%的菌株均为S/wra/fl"o^c///w属菌株，其中与菌株*0"0/^/0^"7/^/"w"m^ATCC15538相似度为99.8%，确定为芽孢乳杆菌的一新菌株。2、菌株Y2-8的选育方法采用低能离子注入法将D-乳酸同型发酵DX12菌株进行诱变后，在pH试剂型平板上筛选，以出发菌变色圈为对照，以变色圈直径大于出发菌株0.5cm为正向突变标准，共筛选到18株产量正突变株；最后，对发酵培养基进行优化，釆用C18柱以HPLC法对16株产量正突变株的发酵产物进行定量测定。经传代发酵试验，获得一株稳定高产D-乳酸菌株，命名为Sjwra/acfokicWiwsp.Y2-8。本发明对芽孢乳杆菌S/7ora/"ctoZw"7/wDX12的诱变突变株Y2-8的生物特征进行了鉴定，对该菌的革兰氏染色观察表明该菌株为G+杆菌，有芽孢，大小为0.5nmx23nm。在平板培养基中生长36h后，菌落大小为1.52mm,生长温度范围是2542'C,最适温度是37。C,生长pH是47.5,最适pH是6.0;其生理生化特性表现在，对过氧化氢酶反应阴性，明胶不液化，不形成吲哚，不还原硝酸盐，石蕊牛奶不变色。纤维醇、麦芽糖、D-蔗糖、甘露糖及a-D-乳糖利用结果为阳性，D-阿拉伯糖、D-半乳糖及柠檬酸利用结果为阴性，在兼性厌氧条件下生长。二、利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，包括平板培养、种子培养和发酵产酸，其特征在于在厌氧条件下进行平板培养和种子培养后，以淀粉类糖化液为碳源，通过在发酵罐中通入惰性气体的方式进行发酵产酸，使工艺过程全程厌氧进行。(1)平板培养将芽孢乳杆菌Y2-8接种至平板培养基厌氧培养，培养温度3040。C，培养时间2036h;平板培养基重量百分配比为葡萄糖1015%，酵母裔0.10.3%，无水乙酸钠0.20.5%，无水硫酸镁0.010.05%,磷酸二氢钾0.10.3%，琼月旨1.8%,水余量，pH7.0;(2)种子培养将平板培养的芽孢乳杆菌Y2-8接种到种子培养基厌氧培养，培养温度3040。C,培养时间1218h。种子培养基所需的碳源包括浓度为2%5%的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；种子培养基所需的氮源包括浓度为0.2%1.0%的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮的一种或多种的混合物；种子培养基中的无机离子重量百分配比为无水硫酸镁0.010.05%,硫酸亚铁0.0010.005%,硫酸锰0.0010.005%,碳酸钙1.53%,水余量，pH7.0。种子培养阶段通过23cm液体石蜡液封，或增大装液量的同时降低转速而实现厌氧培养；种子培养阶段中可在摇瓶中添加玻璃珠，以增强传质效果。(3)发酵产酸将种子培养液接种到发酵培养基中进行产酸发酵，直接以淀粉类糖化液为碳源，接种量为5%10%(v/v),发酵温度304(TC，以总流速每升培养基0.62L/min量通入惰性气体，采用中和剂将发酵体系pH控制在5.07.0，发酵72120h。发酵产酸培养基的碳源包括浓度为10%18%的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；发酵产酸培养基的氮源包括浓度为0.2%2.0%的尿素、硫酸铵、氨水、酵母有、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；发酵产酸培养基中的无机离子重量百分配比为无水硫酸镁0.010.1%,硫酸亚铁0.0010.01%,硫酸锰0.0010.01%,水余量，pH7.0。发酵产酸所用的中和剂包括KOH、NaOH、Na2C03、CaC03、CaO、氨水、碳氨中的一种或多种的组合。本发明的有益效果在于提供了一株稳定高产高光学纯D-乳酸的菌株；而本发明利用该菌株发酵生产D-乳酸的工艺，从平板培养、种子培养到发酵产酸一直保持厌氧条件，无需严格分步调控，搡作简单；本发酵工艺的各步培养基成分易得，且配方简单，生产成本较低；利用本发明的菌株和发酵工艺生产的D-乳酸光学纯度高达99.1。/。，且发酵液中0-乳酸含量达9.1%16.5%，具有重大的社会意义和经济价值。本发明的微生物分类命名为芽孢乳杆菌Spora/a"o6ac77/Msp.Y2-8,保藏曰期为2008年4月IO日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号:CCTCCNo:M208052。具体实施例方式实施例l本实施例说明芽孢乳杆菌Y2-8的选育方法。1、从土壤中筛选产D-乳酸原始菌株以100g/L葡萄糖高糖液体培养基对南京地区土壤样品中的耐高糖微生物进行富集培养，再通过100g/L葡萄糖-溴甲酚绿显色平板在厌氧培养条件下对耐高糖的产酸菌株进行单离，挑选变色圈直径大且变色速度快的菌株进行产酸发酵研究。产物的光学纯度检测采用高效液相色谱手性固定相法进行检测，配位体交换柱型号为SumichiralCA5000，流动相为lmM的CuS04溶液，紫外检测波长为254nm。获得一株D-乳酸菌株，命名为Spora/actokjc///^DX12,超低温保藏备用。2、菌株Y2-8的选育方法为(1)低能离子注入诱变取厌氧培养3天的Spora/a"o6acz7/wsDX12菌泥，用0.85%的生理盐水制成菌悬液，于无菌空白培养皿制成菌膜后进行离子注入。离子能量为10keV,注入剂量为0.40x1015、2.4x1015、4.4xl015、6.60xl015ions/cm2，注入时间为5s，间隔时间为15s。(2)pH试剂型平板筛选用生理盐水洗脱菌膜，将菌悬液涂布于150^葡萄糖-溴甲酚绿显色平板后置于37'C厌氧培养。以出发菌变色圏为对照，以变色圈直径大于出发菌株0.5cm为正向突变标准，共筛到16株产量正突变株。采用C18柱以HPLC法对发酵产物进行定量测定，流动相为2.5mM的NH4H2P04溶液，紫外检测波长为230nm。产物的光学纯度检测釆用高效液相色谱手性固定相法进行检测，配位体交换柱型号为SumichiralCA5000,流动相为1mM的CuS04溶液，紫外检测波长为254nm。18株产量正突变株D-乳酸发酵结果如表1所示。表l产量正突变株D-乳酸定量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)遗传稳定性试验经传代发酵试验考察遗传稳定性后，获得一株稳定高产D-乳酸菌株，命名为Y2-8。菌株Y2-8传代发酵试验结果如表2所示。表2菌株Y2-8的遗传稳定性实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、发酵培养基优化依次对初始发酵培养基碳源、氮源、无机离子和中和剂的种类及浓度进行优化。菌株Y2-8在优化后条件下获得了16.5%乳酸发酵结果，D-乳酸光学纯度达99.iy。。实施例2本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。平板培养基葡萄糖10%,酵母膏0.2%，无水乙酸钠0.2%，无水硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.2%,琼脂1.8%,水余量，pH7.0;种子培养基葡萄糖2%,酵母奢0.3%,玉米浆0.4%,麸皮0.3%,无水硫酸镁0.02%，硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,碳酸鈣1.5%，水余量，pH7,0;发酵培养基葡萄糖10%,玉米浆1.5%，无水硫酸镁0.05%，硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,水余量，pH7.0。将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度30'C,培养时间36h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，加入10粒玻璃珠，并以23cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37'C，培养转速为120rpm,培养12h后，当种子液0066()1达到5左右时即可转接进入发酵培养。选用5.0L发酵罐，配制3.5L发酵培养基，以5%接种量进行接种，以总流速0.06L/min量通入氮气，发酵温度30'C，以流加氨水的形式发酵体系pH控制在5.0,搅拌转速150rpm，发酵96h,采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达9.1%,光学纯度为99.03%。实施例3本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。平板培养基葡萄糖12%,酵母膏0.1%，无水乙酸钠0.3%,无水硫酸镁0.03%,磷酸二氢钾0.3%,琼脂1.8%,水余量，pH7.0;种子培养基葡萄糖5%,牛肉膏0.6%，无水硫酸镁0.01%,硫酸亚铁0.003%，硫酸锰0.005%,碳酸锦2%,水余量，pH7.0。发酵培养基玉米糖化液(葡萄糖计)10%,酵母膏0.2%，无水硫酸镁0.05%,硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,水余量，pH7.0。将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度37°C,培养时间30h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，以2-3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度40。C,培养转速为150rpm，培养时间18h,当种子液OD66o，达到5左右时即可转接进入发酵培养。选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以7.5%接种量进行接种，以总流速0.06L/min量通入氮气，发酵温度4(TC,通过流加NaOH溶液使发酵体系pH控制在7.0,撹拌转速250rpm，发酵72h，釆用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达9.3%，光学纯度为98.8%。实施例4本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺，平板培养基葡萄糖15%,酵母裔0.3%，无水乙酸钠0.5%，无水硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%,琼脂1.8%，水余量，pH7.0;种子培养基葡萄糖和玉米糖化液混合液5%,酵母嗇0.3%,蛋白胨0.2%，无水硫酸镁0.05%,硫酸亚铁0.005%,硫酸锰0.003%,麸皮0.5%,碳酸锦3%，水余量，pH7.0。发酵培养基玉米糖化液(葡萄糖计)10%,蛋白胨1.0%,无水硫酸镁0.05%,硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,碳酸钧5%，水余量，pH7.0。将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度40'C,培养时间20h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，加入10mL玻璃珠，并以3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37"C，培养转速为120rpm,培养时间18h,当种子液OD660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10%接种量进行接种，以总流速0.06L/min量通入氮气，发酵温度37'C,pH控制在5.0,搅拌转速200rpm，发酵120h,釆用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达9.3。/。，光学纯度为99%。实施例5本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。平板培养基同实施例2。种子培养基葡萄糖3%,酵母膏0.2%,无水硫酸镁0.02%，硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,碳酸钩1.5%,水余量，pH7.0。发酵培养基玉米糖化液加部分葡萄糖至葡萄糖浓度达15%,牛肉膏1.2%,无水硫酸镁0.05%,硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,氧化钙6%,水余量，pH7.0。将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度3(TC,培养时间36h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为120mL的种子培养基中，加入15粒玻璃珠，培养温度37'C,培养转速为100rpm,培养时间18h,当种子液OD660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以5%接种量进行接种，以总流速0.06L/min量通入氮气，发酵温度37'C，通过流加NaOH使发酵体系pH控制在6.0，搅拌转速300rpm，发酵120h,采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达13.6%,光学纯度为99%。实施例6本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。平板培养基:同实施例3。种子培养基玉米糖化液3%，玉米浆1.0%，无水硫酸镁0.02%,硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,碳酸钩1.5%,水余量，pH7.0。发酵培养基葡萄糖15%，酵母膏1.0%，麸皮0.4%，无水硫酸镁0.05%，硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,碳酸钙4%，水余量，pH7.0。将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度37°C,培养时间30h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，加入IO粒玻璃珠，并以2cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37'C,培养转速为110rpm,培养时间13h,当种子液OD66tan达到5左右时即可转接进入发酵培养。选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10%接种量进行接种，以总流速lL/min量通入氮气，发酵温度35'C，间歇性流加碳酸钠溶液维持发酵体系pH控制在6.0,搅拌转速200rpm，发酵120h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达14.5%,光学纯度为99.1%。实施例7本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。平板培养基同实施例4。种子培养基玉米糖化液5%，麸皮1.0%，无水硫酸镁0.02%,硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,碳酸锦1.5%,水余量，pH7.0。发酵培养基玉米糖化液(葡萄糖计)15%,酵母膏0.5%,蛋白胨0.5%，硫酸铵0.4%,无水硫酸镁0.05%,硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,碳酸钙4%,水佘量，pH7.0。将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度4(TC，培养时间20h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，以2cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37'C,培养转速为110rpm，培养时间18h，当种子液OD660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10%接种量进行接种，以总流速0.06L/min量通入氮气，发酵温度42'C,流加碳氨使发酵体系pH控制在5.0,搅拌转速200rpm,发酵96h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达14.2%,光学纯度为99.1%。实施例8本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。平板培养基同实施例2。种子培养基玉米糖化液2%，蛋白胨0.6%,无水硫酸镁0.02%，硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%，碳酸钩1.5%,水余量，pH7.0。发酵培养基葡萄糖18%,酵母膏0.4%,牛肉奢0.4%,玉米浆0.4%,尿素0.4%,无水硫酸镁0.05%，硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,水余量，pH7.0。将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度30'C,培养时间36h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，以2cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37'C,培养转速为120rpm,培养时间18h,当种子液OD66o，达到5左右时即可转接进入发酵培养。选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10%接种量进行接种，以总流速0.2L/min量通入氮气，发酵温度35'C，流加碳氨使发酵体系pH控制在6.0,搅拌转速300ipm，发酵96h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达15.9%,光学纯度为99.0%。实施例9本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。平板培养基同实施例3。种子培养基葡萄糖和玉米糖化液混合液5%，酵母膏0.3%，蛋白胨0.2%，无水硫酸镁0.02%,硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,麸皮0.5%,碳酸钩1.5%,水余量，pH7.0。发酵培养基玉米糖化液(葡萄糖计)18%,酵母奢0.5%，蛋白胨0.4%,麸皮0.7%，氨水0.4%,无水硫酸镁0.05%，硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,碳酸钩5%,水余量，pH7.0。将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中，培养温度37'C，培养时间30h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，加入IO粒玻璃珠，并以3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37'C，培养转速为120rpm,培养时间18h，当种子液OD柳nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10%接种量进行接种，以总流速0.2L/min量通入氮气，发酵温度37t:,流加碳酸钠使发酵体系pH控制在5.0，搅拌转速200rpm,发酵120h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达15.8%,光学纯度为99%。实施例10本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。平板培养基同实施例4。种子培养基葡萄糖和玉米糖化液混合液5%,酵母有0.3%,蛋白胨0.2%,无水硫酸镁0.04%，硫酸亚铁0.001%,硫酸锰0.001%,麸皮0.5%,碳酸锦1.5%,水余量，pH7.0。发酵培养基葡萄糖和玉米糖化液混合液(葡萄糖计)18%，酵母奢0.6%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.4%,无水硫酸镁0.05%,硫酸亚铁0.001%，硫酸锰0.001%，碳酸钩5%，水余量，pH7.0。将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧条件下，培养温度40'C，培养时间20h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，加入10mL玻璃珠，并以3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37'C，培养转速为120rpm,培养时间18h,当种子液OD66(^达到5左右时即可转接进入发酵培养。选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10%接种量进行接种，以总流速0.2L/min量通入氮气，发酵温度37'C，流加氨水使发酵体系pH控制在6.0,搅拌转速200rpm,发酵120h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达16.3%,光学纯度为99.1%。权利要求1、一株高光学纯度D-乳酸生产菌，分类命名为芽孢乳杆菌Sporolactobacillussp.Y2-8，其保藏登记号为CCTCCNoM208052。2、利用权利要求1所述芽孢乳杆菌印woto"o&ad〃wssp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，包括平板培养、种子培养和发酵产酸，其特征在于在厌氧条件下进行平板培养和种子培养后，通过在发酵罐中通入惰性气体的方式进行发酵产酸，使工艺过程全程厌氧进行。3、根据权利要求2所述芽孢乳杆菌S/wra/flc/o6flC77/wsp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于(1)平板培养将芽孢乳杆菌Y2-8接种至平板培养基厌氧培养，培养温度3040°C,培养时间2036h;(2)种子培养将平板培养的芽孢乳杆菌Y2-8接种到种子培养基中进行厌氧培养，培养温度304(TC,培养时间1218h;(3)发酵产酸将种子培养液接种到发酵培养基中进行产酸发酵，直接以淀粉类糖化液为碳源，接种量为5%10%(v/v),发酵温度3040。C,以总流速每升培养基0.6~2L/min量通入惰性气体，釆用中和剂将发酵体系pH控制在5.07.0,发酵72120h。4、根据权利要求2和3所述芽孢乳杆菌S戶ra/flcfo6fld//^sp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的平板培养基重量百分配比为葡萄糖1015%,酵母奢0.10.3%,无水乙酸钠0.20.5%,无水硫酸镁0.010.05%,磷酸二氢钾0.10.3%，琼脂1.8%,水余量，pH7.0。5、根据权利要求2和3所述芽孢乳杆菌S/oro/ac/o6acz7/wsp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的种子培养基的碳源包括浓度为2%5%的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；氮源及生长因子包括浓度为0.2%1.0%的酵母裔、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；无机离子重量百分配比为无水硫酸镁0.01~0.05%,硫酸亚铁0.0010.005%，硫酸锰0.0010.005%,碳酸钩1.5~3%,水余量，pH7.0。6、根据权利要求2和3所述芽孢乳杆菌S/ora/acto6。c///wssp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的发酵产酸培养基的碳源包括浓度为10%18%的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；氮源及生长因子包括浓度为%2.0%的尿素、硫酸铵、氨水、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；无机离子重量百分配比为无水硫酸镁0.010.1%,硫酸亚铁0.0010.01%，硫酸锰0.0010.01%，水余量，pH7.0。7、根据权利要求2和3所述芽孢乳杆菌Spora/""ok^77wsp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的种子培养阶段以23cm液体石蜡液封，或增大装液量的同时降低转速而实现厌氧培养。8、根据权利要求2和3所述芽孢乳杆菌S戶ra/a"o6ac!7Ztwsp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的种子培养阶段中可在摇瓶中添加玻璃珠，以增强传质效果。9、根据权利要求2和3所述芽孢乳杆菌Spora/acto6an7/i/ssp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的发酵产酸阶段所用的中和剂包括NaOH、KOH、Na2C03CaC03、CaO、氨水、碳氨等一种或多种的组合。全文摘要本发明公开了一株高光学纯度D-乳酸生产菌，芽孢乳杆菌Sporolactobacillussp.Y2-8菌株及其发酵生产D-乳酸的工艺。整个发酵工艺包括平板培养、种子培养和发酵产酸，从平板培养、种子培养到发酵产酸一直保持厌氧条件，无需严格分步调控，操作简单；本发酵工艺的培养基成分易得，且配方简单，生产成本较低；利用本发明的菌株和发酵工艺生产的D-乳酸光学纯度高达99.1％，且发酵液中D-乳酸含量达9.1％～16.5％，具有重大的社会意义和经济价值。文档编号C12N1/20GK101285047SQ200810098908公开日2008年10月15日申请日期2008年5月16日优先权日2008年5月16日发明者何冰芳,柏中中,欧阳平凯,王丽娟,许婷婷申请人:南京工业大学