量高的厌氧培养液按10 1梯度稀释，用涂布法接种于固 体分离培养基中在30°C、严格厌氧条件下培养5-7天。选取单个菌落继续在相同条件下划 线培养7天以进一步纯化，反复多次，直到得到纯菌株。然后挑选单菌落斜面保存，或接入 液体培养基中进行培养，培养液用甘油保存在_80°C冰箱。
[0037] (2)菌种复筛
[0038] 将获得的纯菌株，再次接入以乳酸为碳源的液体培养基中，在30°C严格厌氧条件 下培养5-7天，观察并验证是否能够转化乳酸并产生己酸，复选出转化速率快、己酸产量高 的菌株保存备用。
[0039] (3)纯菌检测与验证
[0040] 首先通过菌落形态、颜色和显微镜检观察细菌，初步判定是否是纯菌株；然后通过 PCR扩增菌液的16srRNA基因序列，直接测序确定是否为纯菌株。
[0041] 3、菌种培养
[0042] 挑取一环斜面菌种接入含上述培养基的厌氧管中，150rpm，，30°C培养3天，可获 得浓度约10sCFU/mL的种子培养液。
[0043] 实施例二菌种的培养与鉴定
[0044] 1、形态特征
[0045] 菌落形态：梭菌CGMCCNo:9926在平板上培养7天后，菌落圆形，呈乳白色，光滑湿 润，稍凸起，较粘稠，易挑取，菌落直径1. 5mm。
[0046] 菌体形态：革兰氏染色阳性，菌体呈球状，直径2.0-2. 5um。电镜照片参见图 1(SEM，5200X)
[0047] 2、生理生化特征
[0048] 用BiologANMicroPlates?和API20A厌氧鉴定系统分析得出该梭菌的生理生 化特征如表1。
[0049] 表1CPC-11的生理生化特征
[0052] 3、分子生物学特征
[0053] 采用细菌16SrRNA通用引物对27f-1492r扩增菌株CPC-11的16SrRNA，将扩增 约1500bp的目的片断克隆到E.coliDH5a中，采用ABI3730测序仪测序。获得CPC-11的 16SrRNA基因长度为 1325bp，参见SEQIDNo. 1。
[0054] 通过序列比对分析，该菌株与数据库中的梭菌模式种（Clostridium sporosphaeroidesDSM1294) 94. 48 % 相似，与ClostridiumleptumDSM753 有 93. 27 % 相 似。根据细菌新种判定的重要标准（16SrRNA序列相似性〈97%)判断CPC-11为瘤胃菌科 ClostridiumclusterIV(第IV簇）的一个新种。与CPC-11最相似的模式菌株如表2,基 于16SrRNA的系统发育进化树如图2所示。
[0055] 表2与CPC-11最相似的模式菌株
[0056]
[0057]
[0058] 4、菌株的保藏
[0059] 将获得的CPC-11(Clostridiumsp.CPC-11)纯菌株，寄到中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，邮编100101)进行专利菌种保藏。保藏中心经菌种复核与活性检测后，于2014年11 月3日出具专利菌种保藏证书，编号CGMCCNo:9926。
[0060] 实施例三初始pH值对产己酸的影响试验
[0061] 采用液体培养基（见实施例1)，加乳酸至终浓度为l〇g/L，用氢氧化钠和盐酸调节 培养基的酸碱度，得到初始pH分别为5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0共6个酸碱梯度，充N215 分钟，然后分装50mL于250ml厌氧瓶中，121°C灭菌15min。按5% (v/v)接种CPC-11菌液 (浓度约10sCFU/mL)，于30°C摇床150rppm振荡培养7天，测定己酸产量和转化率。结果见 表3〇
[0062] 表3、不同pH对产己酸的影响
[0063]
[0064]
[0065] 由表可知，CPC-11在PH5. 0-6. 5范围内均能较好利用乳酸产己酸，最佳产己酸pH 为6. 0-6. 5,高于7. 0乳酸转化基本停止，只能产生微量的己酸。
[0066] 实施例四底物对CPC-11产己酸的影响试验
[0067] 以实施例1中培养基为基础培养基，配制三种不同底物培养基如下，1#，乳酸 (10g/L) ;2#，乳酸（10g/L)和乙酸（2g/L) ;3#，乙醇（10g/L)和乙酸（2g/L)，充氮气除氧 15min，灭菌后在厌氧操作箱接种5%的CPC-11菌液（浓度约10sCFU/mL)，在30°C培养箱中 培养7天。结果如下：底物仅为乳酸的，己酸产量为3. 02g/L，;底物为乳酸加乙酸的己酸产 量为3. 53g/L，而底物为乙醇和乙酸的没有己酸产生。说明CPC-11可以利用乳酸，或乳酸和 乙酸为底物合成己酸，其中添加乙酸可促进和加快乳酸的转化。但该菌不能利用乙醇和乙 酸为底物产生己酸。表明该菌合成己酸的途径是不同于以往以克氏梭菌为代表的微生物合 成己酸途径（以乙醇和乙酸为底物合成己酸）。
[0068] 表4不同底物对CPC-11产己酸的影响
[0069]
[0070] 实施例四利用黄水发酵产己酸实验
[0071] 将稀释的黄水（乳酸浓度约40g/L)为发酵培养液，加入除氧剂半胱氨酸，再用氢 氧化钠调节pH为6. 0,通氮气除氧，然后接种5 %的CPC-11种子液（浓度约10sCFU/mL)，在 半连续发酵反应器中厌氧培养，控制温度30±2°C。以半连续的培养方式进行实验，即当乳 酸降解完或即将降解完时，排出25%的发酵液，再加入等量的黄水，保证总反应体积不变。 通过液相色谱法测定发酵产物。结果表明，从第3开始产丁酸，到第7天丁酸产量达21. 4g/ L，之后丁酸积累逐渐减少；己酸从第9天开始显著增加，至第13天可达19g/L。
[0072] 本发明瘤胃菌科（Ruminococcaceae)新种Clostridiumsp.CPC-111 的 16SrRNA 序列（SEQIDNo. 1):
【主权项】
1. 瘤胃菌科（Ruminococcaceae)细菌新种，命名为Clostridiumsp.CPC-11，其模式株 的保藏号为CGMCCNo:9926。2. 权利要求1所述的瘤胃菌科（Ruminococcaceae)细菌新种在用乳酸转化生产己酸中 的用途。3. 权利要求1所述的瘤胃菌科（Ruminococcaceae)细菌新种在发酵酿酒中的用途。4. 权利要求1所述的瘤胃菌科（Ruminococcaceae)细菌新种在酒厂酿酒废水处理中的 用途。5. 权利要求1所述的瘤胃菌科（Ruminococcaceae)细菌新种在制备人工窖泥中的用 途。6. 包含权利要求1所述的细菌的菌剂。7. 包含权利要求1所述的细菌的窖泥。8. 包含权利要求7所述的窖泥的窖池。
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种新的瘤胃梭菌CPC-11(Clostridium？sp.CPC-11)及其用途。本发明的提供的新的瘤胃梭菌Clostridium？sp.CPC-11能将乳酸转化为己酸，可利用乳酸或黄水发酵产己酸，同时可用于人工窖泥的强化培养或窖池发酵的“增已降乳”工艺，提高己酸产量，具有很好的应用前景。CGMCC No:992620141103
【IPC分类】C12R1/145, C02F3/34, C12P7/40, C12G3/02, C02F103/32, C12N1/20
【公开号】CN105420168
【申请号】CN201511025819
【发明人】徐姿静, 陶勇, 徐占成, 何晓红, 唐清兰, 樊科权
【申请人】四川剑南春（集团）有限责任公司, 中国科学院成都生物研究所
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月30日