南极来源芽孢杆菌n311及其在防治植物致病真菌上的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及芽孢杆菌，尤其是涉及一种芽孢杆菌N311及其在制备防治植物致病 真菌发酵上清液中的应用。
【背景技术】
[0002] 植物病害是严重威胁农业生产的重要因素，据联合国粮农组织（FA0)统计，每年 因遭受植物病害而造成的减产损失平均为总产量的10%~15%。目前，由于化学农药的大 量使用，不仅带来了植物病原菌产生抗药性的问题，而且对生态环境和人类健康也造成了 潜在危害。研制开发广谱、高效、低毒的生物农药已成为研究人员和农药使用者的共同目标 (CalvoJ,CalventeV,etal. 2007)〇
[0003] 近年来，从陆地土壤微生物中发现结构新颖的活性物质出现了明显下降的态势。 海洋占地球表面的70%以上，蕴藏着丰富的生物资源。迄今海洋生物中已发现包括生物碱 类、萜类、大环聚酯类、肽类以及多糖类等多种新型活性物质。研究表明，许多海洋生物活性 物质具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗艾滋病、抗疲劳及增强免疫等功效（缪辉南，方旭东， 焦炳华.1999)。由于南极独特的地理及气候特征，形成了一个干燥、酷寒、强辐射的自然环 境，蕴育了丰富多样、功能特殊的微生物资源，主要包括生活在海水、海洋沉积物及与海洋 动植物共附生的微生物（曾胤新，陈波，1999)。这些新颖独特的南极海洋微生物是发现新 型生物活性产物的理想来源（朱建钢，颜其德，凌晓良.2005)。
[0004] 芽胞杆菌（Bacillusspp.)由于能产生耐热抗逆的芽胞，是土壤和植物微生物生 态的优势种群。芽胞杆菌能通过同化作用产生抗菌物质，抑制有害病原微生物的生长或者 直接杀灭病原微生物（严婉荣，赵廷昌，等.2013)。许多天然分离的芽胞杆菌菌株已成 功地应用于植物病害生物防治，如日本东京研究所研发的商品菌B.subtilisRB14和美国 Taensa公司研发的商品菌B.amyloliquefaciensFZB42,主要用于防治农作物的枯萎病和 根腐病。我国南京农业大学开发了B.subtilisG1和B.subtilsB3,前者主要用于防治辣 椒病毒病和烟草病毒病，后者则用于防治小麦纹枯病（邓建良，刘红彦，等.2010)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一株芽孢杆菌（Bacillussp. )N311。
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种芽孢杆菌（Bacillussp. )N311在制备防治植物 致病真菌发酵上清液中的应用。
[0007] 所述芽孢杆菌（Bacillussp. )N311分离自中国第31次南极科学考察所采集的海 水样品（59° 00'22. 95〃W，62° 13'03. 316〃S);该菌已于2015年10月15日保藏于中国典 型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072， 保藏中心保藏编号为CCTCCNO:M2015607。
[0008] 所述芽孢杆菌（Bacillussp. )N311通过聚合酶链式反应（PCR)扩增其16SrDNA 序列，与美国国家生物技术信息中心（NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对分析， 发现其与芽孢杆菌属（Bacillussp.)具有99%的序列相似性；16SrDNA序列的GenBank 登录号为KT962248。
[0009] 所述芽孢杆菌（Bacillussp. )N311的16SrDNA部分序列如下：
[0012] 所述芽孢杆菌（Bacillussp.)N311可在制备防治植物致病真菌发酵上清液中应 用。
[0013] 所述防治植物致病真菌发酵上清液的制备方法如下：首先将芽孢杆菌（Bacillus sp. )N311在含有5mLLB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到500mL LB培养基中进行发酵培养，发酵培养结束后离心除去菌体，得到防治植物致病真菌发酵上 清液。
[0014] 所述LB培养基的组成为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，121°C 高灭压菌20min。
[0015] 所述离心除去菌体是在10, 000r/min下离心15~20min。
[0016] 所述活化培养的时间为12~24h。
[0017]所述发酵培养的温度为28~30°C，发酵培养的时间为48~60h，发酵培养的摇床 转速为180~220r/min。
[0018] 所述植物致病真菌包括但不限于镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄 链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌和胶孢炭疽菌。
[0019] 所述防治植物致病真菌发酵上清液的使用方法如下：将防治植物致病真菌发酵上 清液直接或稀释后喷洒在植物上。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0021] 发酵上清液的制备工艺简单，抑真菌谱广，生防效果好。在油菜菌核病（核盘菌） 的盆栽防治试验中显示出较好的生物防治效果，防效达到50%以上。
【附图说明】
[0022] 图1为芽孢杆菌（Bacillussp. )N311的菌落形态。
[0023] 图2为芽孢杆菌（Bacillussp. )N311的发酵上清液对不同植物致病真菌的抑菌 效果图。在图2中：A:灰霉菌；B:宛氏拟青霉；C:核盘菌；D:绿色木霉；E:立枯丝核菌；F: 长柄链格孢；G:胶孢炭疽菌；Η:互生链格孢；I:镰刀菌；J:香蕉炭疽菌。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明作进一步描述。
[0025] 实施例1:芽孢杆菌（Bacillussp.)N311的分离筛选
[0026] 本发明涉及芽孢杆菌（Bacillussp.)N311来源于本申请人从中国第31次南极科 学考察所采集的海水样品中筛选获得。该菌在LB培养基上生长，28°C培养24h后，菌体呈 淡黄色，菌落表面粗糙、干燥，边缘不规则，见图1。
[0027] 实施例2 :芽孢杆菌（Bacillussp.)N311菌种鉴定
[0028]利用 16SrDNA通用引物 27F和 1492R(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAT;1492R: ACGGCTACCTTGTTACGACTT)对南极来源菌株N31116SrDNA序列进行扩增。以N311总 DNA为PCR扩增模板，在PCR扩增仪上进行PCR反应。反应条件为：94 °C变性lmin; 55°C退火lmin;72°C延伸1.5min，30个循环。扩增序列经测序公司测序后，获得该菌 株16SrDNA序列。将该序列通过与美国国家生物技术信息中心GenBank中核酸数据进 行比对分析（ http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)。结果显示，N311 的 16SrDNA序列与 Bacillusmethylotrophicus(HQ662596. 1)、Bacillusamyloliquefaciens(JF460737. 1)、 及Bacillusamyloliquefaciens(JQ062537. 1)等菌株的序列相似性为99%，即芽孢杆菌 (Bacillussp.)N311与芽孢杆菌同源，因此，将其命名为芽孢杆菌（Bacillussp.)N311。
[0029] 实施例3:植物致病真菌抗菌谱的测定
[0030] 采用纸片法测定芽孢杆菌（Bacillussp.)N311对10种植物致病真菌的抑制活 性。用无菌打孔器将受试致病真菌制成菌块，用牙签挑取一菌块接种于马铃薯固体培养基 平板中央，28°C的条件下培养。待受试致病真菌菌丝体扩散生长后，将灭菌的双层滤纸片 (直径6mm)放置于菌块四周，滤纸片距离菌丝边缘约lcm。在每个滤纸片上加50μL的无 菌发酵上清液，继续培养24h，通过与对照组比较，观测菌丝体