假单胞菌（Pseudomonas protegens）S63及其在防治水葫芦中的应用
【技术领域】：
[0001 ] 本发明属于生物防治领域，具体设及假单胞菌(Pseudomonas p;rotegens)S63及其 在防治水葫芦中的应用。
【背景技术】：
[0002] 水葫芦又名凤眼莲，英文俗名为Water hya cin化，学名[Eiclihornia crassioes (Ma;rt. )Solms.]，属单子叶植物纲（Monocotyledoneae)百合目化iliflorae)雨久花科 (Pontederiaceae)凤眼兰属。水葫芦原产南美洲，具有耐碱性、耐肥、抗污染力强、天敌少、 抗病力强、入侵能力强等生长特性。广泛分布于河流、湖泊和水塘中，覆盖水面，堵塞河道， 影响航运及水上作业；同时，降低阳光对水体的穿透力，影响水底生物生长，并增加水体二 氧化碳浓度，影响水产品的产量和质量，并对当地居民饮水、健康造成威胁。2003年我国环 保局将水葫芦列为首批最危险的16种外来入侵物种之一。
[0003] 国内外开展与水葫芦的斗争已经长达数十年之久，目前主要W打拱和化学药剂处 理为主。我国各地面对泛滥成灾的水葫芦主要还是采用人工和机械方式进行打拱，不但耗 费了大量的人力、物力，而且在水葫芦爆发期还会出现打拱速度跟不上繁殖速度的现象。国 际上也有用除草剂来控制水葫芦的。目前，研究和应用较多的化学除草剂有2,4-D、敌草快、 百草枯和农达等。运些化学除草剂防除水葫芦见效快，但很多国家并没有接受运种治理方 法。首先，成本太高，对一些经济欠发达的国家来说是不适用的。其次，对水体生态环境破坏 性大。此外，由于水葫芦繁殖速度快，一旦有新的来源又会快速生长，所W控制效果不能够 持久。
[0004] 近年来，利用植物病害菌防治水葫芦的生物防治的方法成为水葫芦治理的一个热 点研究领域，生物防治法具有成本低、效果长效和对环境友好等优点。但水葫芦病原菌大部 分都为致病真菌，很少有关于水葫芦致病细菌的研究报道。此外，研究表明水体的富营养化 是导致水葫芦迅速繁殖的主要原因，消除水体富营养化是防治水葫芦的根本措施。因此既 能抑制水葫芦生长又能降解水体氨氮等污染物的微生物及其代谢物对水葫芦泛滥具有标 本兼治的防治作用。
【发明内容】
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[0005] 本发明的第一个目的是提供一种对水葫芦具有良好的生物防治效果的假单胞菌 (Pseudomonas p;rotegens)S63,该菌于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中屯、（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为： CGMCC No.11661。
[0006] 本发明的第二个目的是提供了假单胞菌（Pseudomonas p;rotegens)S63在防治水 葫芦中的应用。
[0007] 所述的应用优选是在制备防治水葫芦制剂中的应用。
[0008]本发明的第Ξ个目的是提供一种防治水葫芦制剂，其特征在于，含有有效量的假 单胞菌（Pseudomonas protegens)S63作为活性成分。
[0009]本发明的第四个目的是提供假单胞菌（Pseudomonas p;rotegens)S63在净化富营 养化水体中的应用。
[0010] 所述的应用优选是在制备净化富营养化水体制剂中的应用。
[0011] 本发明的第五个目的是提供一种净化富营养化水体制剂，其特征在于，含有有效 量的假单胞菌(Pseudomonas p;rotegens)S63作为活性成分。
[0012] 本发明的假单胞菌(Pseudomonas p;rotegens)S63经初步研究表明对水葫芦具有 选择性致病性，同时对富营养化水体亦具有较好的净化效果，对水葫芦的防治可取到标本 兼治的功效，为水葫芦的生物防治提供了一种新的思路和方法，具有推广应用的价值。
[0013] Pseudomonas protegens S63于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为： CGMCC No.11661。
【附图说明】：
[0014] 图1是对照组和实验组叶片中的超氧化物歧化酶、丙二醒和过氧化氨酶的酶活；
[001引图2是实验组和对照组在112小时内的氨氮和COD的降解曲线。
【具体实施方式】：
[0016] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0017]实施例1:
[001引 （1)菌株筛选
[0019] 取水葫芦病株的叶片，用次氯酸溶液擦洗，无菌水冲洗Ξ遍，研磨，取汁，涂布于水 葫芦琼脂平板培养基上。从水葫芦病株所处的水体中，取ImL水样涂布在水葫芦琼脂平板培 养基上，28°C培养箱培养2-4d。挑取单菌落，并进行菌株纯化，将纯化后的菌株，保存在PDA 斜面。
[0020] 将纯化菌株点种于氨氮平板培养基上，28°C培养2-4d，挑取保存产生透明圈的菌 株。
[0021] 取正常生长的水葫芦植株，用70%酒精反复擦洗其茎部表面，无菌水冲洗数次，剪 取约5cm长的小段，置于垫有无菌滤纸的培养皿中，加入少许无菌水，W保持一定的湿度， 将初筛获得的纯化菌株接种于水葫芦茎处，置室溫培养，选取能致水葫芦茎部出现黑斑的 菌株。将上述筛选获得的菌株接入发酵培养基中，28°C培养2-4d，按0.5 %-2.5 %比例吸取 菌液加入到改良霍格兰氏营养液中，再在其中移入生长正常的水葫芦植株，同时W不添加 菌液作为空白对照，均设立Ξ组平行对照。于25°C光照培养箱中培养15-20d，记录观察结 果。选取对水葫芦生长具有最强抑制效果的菌株，命名为菌株S63。
[0022] 所用培养基：
[0023] 水葫芦琼脂平板培养基:水葫芦茎40-60g，加少许水磨碎取汁，加琼脂20g，用自 来水定容到1000ml，灭菌备用。
[0024] PDA培养基:马铃馨lOOg，葡萄糖lOg，琼脂2g，蒸馈水1000ml，灭菌备用。
[0025] 氨氮平板培养基：巧樣酸Ξ钢3g，NH祉P〇4 0.4g，K此P〇4 Ig，化Cl 3g，琼脂20g，蒸 馈水1000ml，抑7.2-7.4,灭菌备用。
[00%]发酵培养基：蛋白腺0.5g，酵母膏1.5g，葡萄糖5g，脈0.2克，硫酸儀0.1克，K抽P〇4 0.1邑，船(：10.5邑，自来水10001111，抑7.2，灭菌备用。
[0027]改良霍格兰氏营养液配方：四水硝酸巧945mg/L，硝酸钟506mg/L，硝酸锭80mg/L， 憐酸二氨钟136mg/L，硫酸儀493mg/L，铁盐溶液2.5ml/L，微量元素液5ml/L，抑=6.0，溶剂 为水。
[00巧]铁盐溶液配方:屯水硫酸亚铁2.78g，乙二胺四乙酸二钢化DTA.化)3.73g，蒸馈水 500ml，抑=5.5。
[0029] 微量元素液配方:舰化钟0.83mg/l，棚酸6.2mg/L，硫酸儘22.3mg/L，硫酸锋8.6mg/ L，钢酸钢0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钻0.025mg/L，溶剂为水。
[0030] (2)菌株鉴定
[00川将培养3d的菌株S63接种到40mL LB培养液的Ξ角瓶（lOOmL)中，于35°C、160r/ min，恒溫振荡培养4她后制成菌体悬浮液，离屯、收集菌体，采用CTAB/化Cl法提取菌株基因 组DM。采用细菌通用引物27F(5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）对提取的DM进行PCR扩增。将扩增后的DNA产物送至上海生工生 物有限公司进行纯化测序，其16S rRNA的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。用BLAST软件与 NCBI的GenBank数据库收录的的16S rRNA序列进行比对，结果表明菌株S63与Pseudomonas protegens strain Azil5的同源性最高，相似性达99%。确定S63属于假单胞菌，命名为假 单胞菌(Pseudomonas p;rotegens)S63，该菌于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路