一种基于导电高分子的杂交链式反应dna检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于光电材料技术领域，具体涉及一种基于导电高分子的杂交链式反应DNA检测方法。
【背景技术】
[0002]共轭聚合物是一类具有特殊光、电性质的高分子化合物，近年来受到了科学家们的广泛关注。共轭聚合物是指在空闻结构上有长程键共轭体系的聚合物，在聚合物共轭体系中，长程电子共轭不仅大大缩小了成键和反键能带间的能隙(一般为1.5?3eV)，而且使两个能带增宽，能带内的轨道数增加，轨道间能隙减小，载流子(电子和空穴)在能带内可以自由移动，因此，共轭聚合物的共轭骨架允许电子或能量在整条链上自由流动，从而具有“分子导线”功能。即受激发产生的激子可以沿共轭主链迅速迀移。通过把季铵盐、铵根、羧酸根、磺酸根集团或寡聚乙二醇等亲水性基团连接到共轭聚合物侧链上，可以使其具有亲水性，变成水溶性共轭聚合物。通过引入阴离子基团，可使整条聚合物在水溶液中带负电荷，能与带正电荷的生物分子发生静电相互作用，相反，如果引入的是阳离子基团，则可以和带负电荷的生物分子发生相互作用。另外水溶性共轭聚合物荧光材料，具有结构多样性、良好的生物相容性、荧光强度高、发光时间长和光化学稳定性好等特性，同现有的无机纳米材料相比，水溶性聚合物材料的制备方法简单，具有光学特性可调控、低毒、生物兼容性佳等优点，因此在材料选择方面，水溶性聚合物材料有非常大的优势。
[0003]杂交链式反应(hybridizat1n chain react1n)是一种新型的放大技术，它主要利用引发链或者目标分子引发DNA聚合作用，实现信号放大，可用于快速灵敏的检测特异的DNA序列(Huang et al.,2011 ； Juan et al.,2012 ；Niu et al.，2010)。杂交链式反应一般由引发链和发夹DNA组成，当加入引发链时，会诱导发夹DNA逐渐解链，驱动形成长的DNA聚合体，实现信号放大。利用杂交链式反应可以实现对多种不同的mRNAs进行同时成像分析，另外杂交链式链式反应不仅可以用来检测蛋白质，而且可以选择靶向癌细胞，在特异性杀死癌细胞的同时又可以避免传统化疗带来的副作用，这些研究说明HCR具有信号放大特性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种操作简单、特异性高、所需设备简单的检测DNA的方法。与传统的基于荧光效应的检测方法相比，这种检测方法不仅利用了共轭聚合物的分子导线效应，也利用了杂交链式反应的信号放大机制，结合荧光共振能量转移(FRET)，可以克服传统荧光生物传感器中荧光强度低、选择性差的缺点，具有高灵敏度、快速响应和强抗干扰能力等优点。
[0005]本发明提出的检测DNA的方法，是以水溶性阳离子共轭聚合物为荧光共振能量转移的供体，修饰染料作为荧光共振能量转移的受体，通过静电作用使阳离子共轭聚合物与染料修饰的带负电的DNA聚合体靠近，发生荧光共振能量转移，结合杂交链式反应的信号放大机制实现对目标DNA的尚灵敏检测。
[0006]当引发链DNA加入到染料修饰的Hl和H2中，会引发Hl、H2逐渐解链，开始杂交链式反应，形成一条长的双链DNA聚合体，然后利用Slnuclease降解溶液中游离的发卡H1、H2，最后加入水溶性阳离子聚合物材料，通过静电作用，线性分子CCP与DNA聚合体结合在一起，发生荧光共振能量转移，利用CCP的强荧光性质和杂交链式反应(HCR)的信号放大机制实现双重放大信号，其步骤如下:
[0007](I)制备水溶性阳离子共轭聚合物材料，并且溶于超纯水中；
[0008](2)染料修饰的两个发卡Hl、H2分别退火处理；
[0009](3)目标DNA加入到染料修饰的发卡Hl和H2中，混合均匀后进行杂交链式反应(HCR)反应；
[0010](4)Slnuclease降解未参与HCR反应而游离在溶液中的发卡H1、H2;
[0011](5)加入水溶性阳离子聚合物溶液，进行荧光检测，根据荧光转移强度实现对目标DNA的定性以及定量检测。
[0012]其中:
[0013]步骤(I)所述的作为敏感材料的共轭聚合物具有很好的光电性质，是一种水溶性好且带有丰富正电荷的线性分子，其吸收波长为404nm，发射波长为450nmo
[0014]两个发卡Hl、H2的核酸序列为
[0015]Hl:5 ’ FAM-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3’
[0016]H2:5 ’-AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG-FAM-3，
[0017]两个发卡DNAHl和H2分别用染料FAM修饰，其吸收波长为490nm，发射波长为520醒，因此FAM的吸收光谱(490nm)与聚合物材料的发射光谱(520nm)存在很好的光谱重叠。
[0018]步骤(2)两个发卡Hl和H2在95°C退火处理，是为了保证Hl和H2都是双茎环结构，从而降低由于水溶性阳离子共轭聚合物与游离的H1、H2结合导致的背景信号。
[0019]步骤(3)中目标DNA的序列为:5’-AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAA-3’。
[0020]当目标DNA出现时，会引发发夹Hl的构象由此发生改变暴露出发夹环，进而不断和打开新的发夹H2，驱动形成一条长的DNA聚合体，并且形成的DNA聚合体上每隔24个碱基就有一个荧光素FAM，满足了荧光共振能量转移的距离条件。
[0021]步骤(3)中所用缓冲液为50mM CH3COONa与IM NaCl的混合溶液，其pH值为7.5。
[0022]步骤(4)SlnucleaSe是一种单链特异性的核酸内切酶，能将单链DNA或RNA降解成为可溶性5 ’ -P核苷酸，也可以降解双链核酸中的单链部分，从而避免了游离的Hl和H2与水溶性阳离子聚合物CCP结合，降低了实验干扰性。
[0023]步骤(5)中所述荧光检测方法为:将水溶性阳离子共轭聚合物材料溶液加入到DNA聚合体溶液中进行荧光发射光谱的扫描，激发波长为404nm，发射波长扫描范围为410nm-650nmo
[0024]本发明具有突出的实质性特点和显著的技术进步，具体如下:
[0025](I)选用可激发荧光的水溶性阳离子共轭聚合物作为敏感材料，水溶性阳离子共轭聚合物在检测中作为荧光共振能量转移的供体，同时其周围丰富的正电荷与带有负电荷的DNA具有很强的静电作用，避免了游离DNA对实验的干扰。
[0026](2)利用杂交链式反应，当目标DNA出现时，会引发发夹Hl的构象由此发生改变，露出发夹环，进而不断打开新的发夹H2，驱动形成一条长的DNA聚合体，从而实现了信号放大。
[0027](3)在结构设计上两个发夹Hl和H2分别在5 ’和3 ’修饰FAM，是为了形成的DNA聚合体每隔24个碱基就有一个FAM染料，这样既满足了荧光共振能量的距离条件，又实现了信号放大。
[0028](4)选择荧光物质FAM进行修饰发夹DNA是因为，FAM的吸收光谱在490nm处，发射光谱在520nm，而共轭聚合物的吸收光谱在404nm，发射光谱在450nm，因此FAM的吸收光谱(490nm)与共轭聚合物的发射光谱(450nm)具有很大程度的光谱重叠，满足荧光共振能量转移的光谱重叠条件。
[0029](5)发明制备方法简单，不需要复杂的设备，通过改变发夹DNA序列可以制备各种生物探针。
[0030]本发明可广泛应用于分子生物学、临床检测、生物传感器等领域，实现对生物分子，小分子，以及金属离子的检测。
【附图说明】