控患者的免疫系统的变化和重建情况，确定患者的预后效果。
[0035] 根据本发明的一些实施例，本发明的方法还可W包括W下步骤：
[0036] 根据前面所述的构建可变区测序文库的方法，构建患者治疗前的样本的TCR或 BCR可变区测序文库；
[0037] 对所述可变区测序文库进行测序，W便确定每个TCR或BCR可变区核酸序列；
[0038] 基于可变区核酸序列，确定各克隆的丰度，并选择丰度超过预定阔值的克隆作为 标志物，其中所述预定阔值基于健康人群外周血或骨髓中存在的最高克隆丰度确定的；W 及
[0039] 检测患者治疗后的样本中所述标志物的残留量。
[0040] 根据本发明的另一些实施例，本发明的方法还可W包括W下步骤：
[0041] 根据前面所述的构建可变区测序文库的方法，分别构建患者治疗前后不同阶段的 样本的TCR或BCR可变区测序文库；
[0042] 对各可变区测序文库进行测序，W便分别确定各样本每个TCR或BCR可变区核酸 序列；W及
[0043] 基于各样本每个TCR或BCR可变区核酸序列，确定患者治疗前后不同阶段的免疫 组库的多样性情况，并进行比较，W便确定患者治疗后的免疫系统重建情况，预测预后效 果。
[0044] 发明人发现，利用根据本发明实施例的确定可变区核酸序列的方法，能够有效地 用于对疾病进行监控。发明人发现，淋己细胞肿瘤患者经化疗诱导至完全缓解后，残留的 肿瘤细胞用一般形态学的方法难W检出，因此需采用灵敏度高、特异性强及稳定可靠的实 验方法检测MRD。目前用于临床评估MRD的技术包括；流式细胞术检测肿瘤细胞表面抗原、 AS0-PCR方法监测免疫球蛋白重链（IgH)、T细胞受体灯CR)克隆性基因重排；RT-PCR的方 法检测特异白血病基因。流式细胞术的检测灵敏度可达到10 4数量级，但数据解读依赖于 操作者和实验室，标准化程度低；并且，细胞表面抗原表达的变化会干扰MRD的检测。利用 病人特异性引物进行实时定量PCR检测，其灵敏度可达到10 5数量级，但该方法需设计患者 特异性引物，操作繁琐，耗时长，成本高。RT-PCR的方法只能检测带有某种基因的肿瘤细胞。 并且W上送Η种方法都都无法监测治疗过程中病人整体的免疫系统重建情况。
[004引 Τ细胞受体灯CR)和Β细胞受体（免疫球蛋白，IG)分别是Τ淋己细胞和Β淋己细 胞表面识别抗原的受体，决定了抗原识别的特异性。不同的淋己细胞的TCR或IG都不同， 形成库容庞大的免疫组库。（1)编码TCR/IG可变区的多个V、D、J Η个基因胚系基因片段 组合的多样性，（2)在Τ/Β细胞的发育过程中VJ和VDJ连接多样性，（3)重排连接的不精确 性W及Ν区核巧酸插入，送Η方面是TCR/IG多样性的产生机制。
[0046] 高通量测序使测定复杂的适应性免疫分子成为可能，通过本发明的方法，可W很 容易地了解个体的抗原受体基因的多样性情况，获得抗原受体基因组的信息。
[0047] 根据本发明的实施例，分别在Τ/Β细胞受体的V基因和J(或C)基因区设计引物， PCR扩增富集代表Τ/Β细胞多样性的CDR3区域，然后分析测序得到的数十万条Τ/Β细胞受 体序列的多样性情况。健康个体的抗原受体基因图谱一般情况下多样性非常高，不会出现 某种基因频率高于5%的情况。在淋己细胞肿瘤患者治疗前的血液中，带有某一种或几种抗 原受体基因的淋己细胞发生克隆性增殖，在淋己细胞群体中占据很高的比例。所W可W将 送种抗原受体基因作为克隆性增殖的细胞的标记（即标志物），用作治疗后MRD监测。
[0048] 需要说明的是，相对于现有技术，根据本发明的实施例的技术方案能够实现下列 优点至少之一：
[0049] (1)无需针对患者设计特异PCR引物或探针，节省人力、时间等。
[0050] 似操作简便，利于标准化，通量高，稳定性好。
[0051] (3)灵敏度高，可达到1〇5数量级W上（能检测到十万个有核细胞中的1个目标 细胞）。
[0052] (4)检测整个抗原受体基因组变化情况，不会因为细胞表面抗原表达的变化或肿 瘤细胞的进化而漏检。
[0053] (5)动态监控患者免疫系统的变化情及重建情况，提示预后效果。
[0054] (6)相对于传统的MRD检测方法，本发明应用免疫组库测序技术对重排后形成的 适应性免疫受体分子（如TCR或Ig)的可变区进行序列测定，通过克隆频率能够找出诊断 样本的致病克隆（即标志物）并在后续治疗后样本中能够对该致病克隆的微小残留量进行 检测，该方法具有灵敏度高，适用性广，操作简便，易于标准化，避免漏检等优点。
[005引 （7)相对于传统的MRD检测方法，本发明可通过测序数据作VDJ pairing图谱，用 于监控患者免疫组库多样性，评估患者的免疫重组情况。
[0056] 需要说明的是，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相 对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可 W明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说 明，"多个"的含义是两个或两个W上。
[0057] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0058] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[005引图1显示了根据本发明一个实施例，多重PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳图。Marker 为 50bp DNA Ladder。
[0060] 图2-图5显示了根据本发明一个实施例，病人1在治疗前后不同时间的v-j基因 配对丰度图。
[0061] 图6-图9显示了根据本发明一个实施例，病人2在治疗前后不同时间的V-J基因 配对丰度图。
【具体实施方式】
[0062] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过描述的实施例是示例性的，仅用于解释 本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内 的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验 指南》，第Η版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商 者，均为可W通过市购获得的常规产品，例如可W采购自Illumina公司。
[0063] -般方法：
[0064] 除非特别说明，在后面的实施例中，采用下列步骤进行分析：
[00财 （1)扩增可变区
[0066] 使用经过优化的一套通用引物通过多重PCR扩增TCR或Ig基因的可变区：
[0067] 可变区由TCR或Ig的V、D、JH种基因片段重排形成，重排过程中基因片段之间的 连接处有核巧酸的插入与缺失，该区域体现了适应性免疫分子表面受体的多样性。为了扩 增可变区，可在V区与J区相对保守的框架区设计引物，然后通过多重PCR的方法在一个反 应中扩增由不同亚家族的V区与J区重排所得的可变区。扩增产物经凝胶电泳回收目标片 段。
[006引 似文库制备
[0069] 方法一：通过连接酶引入，具体步骤包括核酸片段的末修复和接头连接，即；
[0070] 首先，将 DNA 通过 T4 DNA Polymerase、Klenow Rra卵ent 和 T4 F*olynucleotide Kinase等酶的作用W dNTP为作用底物进行末端修复，形成补平的末端磯酸化的DM片段。 如果后续是TA粘性末端连接，可W利用Klenow化agment(3' -5' exo-)聚合酶及dATP在 补平序列的3'末端加上"A"碱基；
[0071] 然后，在T4 DNA Ligase的作用下与接头进行连接。为了方便来源于不同样本制 备的DNA文库混合上机测序并在测序后区分开来，可在接头中引入标签序列W区分不同样 品制备的文库。如果需要富集连接上接头的片段，可W加一步公用引物的PCR。
[0072] 方法二：可W直接在扩增TCR或Ig区域的扩增引物的5'末端加上一段接头序列， 在多重PCR后直接通过公用引物进行第二次PCR将测序接头引入。
[0073] 测序文库可用Η种方法进行纯化，