p等，Acta Otolaryngol.124(4):52〇-6; Harwood等，2004 ,化.J.Dermatol. 150(5): 949-57;Rees等，2004,Clin. 0tola;ryngol. 29 (4):301-6;胖1(13油"611化6'等，2004，1(：1111.￥^〇1.31(4):292-7)。迄今多于100种不同类 型的 HPV 已被鉴定（Antonsson, A.等，2000, J. Virol. 74:11636-11641; Chan, S.Y.等 1995， J. Virol. 69: 3074-3083 ;de Villiers，E.M.等 2004, Virology 324:17-27),其中 40 种已被 报道于肛口与生殖器感染（de Villiers E-M.2001,Papillomavirus Rep. 12:57-63; ￥11116'8 6]\1等，2004，￥山〇1〇邑7.化1120;324(1):17-27)。
[0027] 被接受的是，几乎100%的浸润性宫颈癌和高度癌前上皮内瘤形成与被高风险HPV 感染的感染相关。
[0028] 本公开内容提供了用于制备和检测由人受试者提供的尿液样品中的HPV核酸的方 法和组合物。本公开内容提供了用于从未分级的或非浓缩的尿液样品制备HPV核酸的试剂 和方法。另外，本公开内容提供了识别和结合HPV核酸分子的引物和探针W在存在于人尿液 样品中的核酸之中检测到运些HPV核酸分子。在一些实施方案中，引物和探针检测HPV的E1 基因内的序列。在一些情况下，检测是对于高风险形式的HPV的W鉴定处于发展宫颈癌的风 险之下或处在宫颈癌的早期阶段的女性受试者。在其他情况下，检测是对于在男性受试者 中的HPV感染的。
[0029] 为了便于理解本公开内容，W下定义了许多术语。
[0030] 关于核酸序列的术语"检测"和"分析"HPV指，使用任何观察、确定、现慢或定量信 号的方法指示祀核酸序列在样品中的存在或该祀核酸序列在样品中的绝对或相对量。方法 可与标记核酸方法组合W通过例如：巧光、放射性、比色法、重量分析、X-射线衍射或吸附、 磁、酶活性等提供信号。然后信号可通过适合信号类型的方法检测和/或定量，W确定感兴 趣的特定DNA序列的存在或不存在。
[0031] 关于核酸序列"定量"，指使用任何研究特定核酸序列的量的方法，包括但不限于， 确定核酸序列的拷贝数，或确定核酸序列的拷贝量随时间的变化，或确定当与另一个序列 比较时序列的相对浓度的方法。
[0032] 为辅助检测和分析，特定DNA序列可许多方式被"扩增"，包括但不限于:循环 探针反应(Bekkaoui，F.等，BioTechniques 20，240-248( 1996))、聚合酶链式反应(PCR)、巢 式PCR、PCR-SSCP(单链构象多态性）、连接酶链式反应（LCR)(F.Barany Proc.化 tl. Acad. Sci USA 88 :189-93( 1991))、克隆、链置换扩增（SDAKG.K. Terrance Wa化er等，Nucleic Acids Res. 22:2670-77( 1994)) W及变化形式诸如等位基因特异性扩 增(ASA)。
[00对术语"基因"指包含RNA序列的转录所必需的控制和编码序列的DNA序列。术语HPV "基因组"指HPV的完整基因互补物。
[0034] 术语"寡核巧酸"和"多核巧酸"和"聚合的"核酸是可互换的，并被定义为包含两个 或更多个(优选地多于Ξ个，且通常多于十个)脱氧核糖核巧酸或核糖核巧酸的分子。确切 的尺寸将取决于许多因素，其继而取决于寡核巧酸的最终功能或用途。寡核巧酸可包 括化学合成、DNA复制、反转录，或其组合的任何方式生成。
[0035] 因为单核巧酸进行反应W运样的方式产生寡核巧酸，所述方式使得一个单核巧酸 戊糖环的5'憐酸经由憐酸二醋键在一个方向上被附连至其相邻的3'氧，所W如果寡核巧酸 的5 '憐酸未被附连至单核巧酸戊糖环的3 '氧，则寡核巧酸的该末端被称为"5 '末端"，且如 果寡核巧酸的3'氧未被附连至随后的单核巧酸戊糖环的5'憐酸，则寡核巧酸的该末端被称 为"3'末端"。如本文所用，核酸序列即使在较大的寡核巧酸的内部，也可被称为具有5'末端 和3'末端。
[0036] 当两个不同的、不重叠的寡核巧酸退火至相同线性互补核酸序列的不同区域，且 一个寡核巧酸的3'末端指向另一个寡核巧酸的5'末端时，前者可称为"上游"寡核巧酸，且 后者可称为"下游"寡核巧酸。
[0037] 术语"引物"指当被置于引物延伸被启动的条件下时能够充当合成的起始点的寡 核巧酸。寡核巧酸"引物"可自然发生，在如纯化的限制性消化产物中或可合成产生。核酸分 子的扩增包括引物延伸的多次重复情形。
[0038] 引物被选择为"基本上"与模板的一条特异性序列的链互补。引物必须充分互补W 与模板链杂交W便引物延伸发生。引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，非互补核巧 酸片段可被附连至引物的5'末端，引物序列的剩余部分与链基本上互补。非互补碱基或更 长的序列可散布进引物中，条件是该引物序列具有与模板序列杂交的足够的互补性，并从 而形成模板引物复合体W合成引物的延伸产物。
[0039] "祀"核酸是待通过杂交、扩增或包括多种分析方法的组合的分析核酸序列的任何 其他手段评价的核酸序列。
[0040] "杂交"方法设及互补序列与祀核酸(待分析的序列）的退火。包含互补序列的两个 核酸聚合物找到彼此并通过碱基配对相互作用退火的能力是公认的现象。Marmur和Lane， Proc.化tl.Acad.Sci.USA 46:453(1960)W及Doty等，Proc.化tl.Acad.Sci.USA 46:461 (1960)对"杂交"的最初观察之后是，将该过程改进为现代生物学的重要工具。杂交包括但 不限于狭线杂交、点杂交和印迹杂交技术。杂交可包括部分互补或完全互补。不论所用的方 法如何，杂交需要被分析的序列(祀序列)和用于进行测试的寡核巧酸(探针)之间某些程度 的互补性。如本文所用的术语"杂交"包括"核酸的一条链藉W通过碱基配对与互补链结合 的任何过浩'（Coombs .Dictionary of Biotechnolo邑y, Stockton Press ,New York N.Y. (1994)。
[0041 ]如本文所用的核酸序列的互补物指处于"反向平行缔合（an t i para 11 e 1 association)"状态的寡核巧酸，该寡核巧酸当与核酸序列对齐时使得一个序列的5'端与 另一序列的3'端配对。在天然的核酸中通常不存在的特定碱基可被包含在本公开内容的核 酸中，并且包括，例如，肌巧及7-脱氮鸟嚷岭。互补性不需要是完全的;稳定的双链体可包含 错配碱基对或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可考虑许多变量凭经验确定双链体 稳定性，所述许多变量包括，例如，寡核巧酸的长度、寡核巧酸的碱基组成和序列、离子强度 W及错配碱基对的发生率，和任何错配碱基对在寡核巧酸中的相对位置及关于其他错配的 和互补的碱基对的相对位置。
[0042] 如本文所用，术语"Tm"被用来述及"解链溫度"。解链溫度是一群双链核酸分子被 一半解离为单链时的溫度。用于计算核酸的Tm的等式在本领域是熟知的。如由标准参考文 献所指示的，当核酸在1M NaCl水溶液中时，Tm值的简单估计可通过如下等式计算:Tm= 81.5 +0.41 ( %G+C)(参见例如，Anderson和化ung,Quantitative Filter Hybridisation, in nucleic acid Hybridisation!； 1985))。其他参考文献包括更精细的计算方法，所述更精细 的计算方法将结构W及序列特征考虑到化的计算中。
[0043] 如本文所用的术语"探针"指，无论是自然发生在纯化的限制性消化产物中还是经 合成产生，均由于探针中的至少一个序列与另一核酸中的序列的互补性或其他可重复的吸 引性相互作用的手段，而与另一核酸中的序列形成双链体结构或其他复合体的寡核巧酸 (即，核巧酸序列）。探针在检测、鉴定和分离特定基因序列中是有用的。本公开内容包括用 任何"报道物分子"标记的探针，W便使其在任何检测系统中是可检测的，所述检测系统包 括但不限于酶系统（例如，ELISAW及基于酶的组织化学测定）、巧光系统、放射系统及发光 系统。在一些情况下，感兴趣的寡核巧酸（即，将被检测的寡核巧酸)将被报道物分子标记。 在其他情况下，感兴趣的探针和寡核巧酸二者将被标记。本公开内容不限于任何特定的检 测系统或标记物。
[0044]如本文所用的术语"标记物"指可用于提供可检测的（优选地可定量的）信号并且 可被附连至核酸或蛋白的任何原子或分子。标记物通过许多方法提供可检测的信号，所述 许多方法包括但不限于巧光、放射性、比色法、重量分析法、X-射线衍射或吸收、磁和酶活 性。
[004引术语"基本上单链的"当用于述及核酸祀时意指，祀分子主要地作为单链核酸存 在，与双链祀形成对照，所述双链祀作为通过链间碱基配对相互作用保持在一起的两条核 酸链存在。
[0046] "与基因序列匹配或互补的寡核巧酸引物"指能够促进单链或双链核酸的模板依 赖性合成的寡核巧酸引物。与基因序列匹配或互补的寡核巧酸引物可在PCR、RT-PCR等方法 中使用。
[0047] 如本文所用的"核酸序列"指寡核巧酸、核巧酸、多核巧酸及其片段或部分，并指基 因组来源或合成来源的可为单链或双链的且代表有义链或反义链的DNA或RNA。
[0048] "扩增"被定义为产生另外的核酸序列拷贝，并且通常使用聚合酶链式反应或本领 域中熟知的其他技术（例如，Dieffenbach和Dveksle;r,PCR Primer ,Laborato;ry Manual, Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y. [1995])进行。如本文所用的，术语"聚合酶链 式反座'（"PCR")指K.B.Mullis(美国专利号4,683，195和4,683,202，通过引用在此并入）的 方法，其描述了用于增加基因组DNA混合物中的祀序列的区段的浓度而无需克隆或纯化的 方法。用于扩增祀序列的该过程由W下步骤组成:将大量过量的两种寡核巧酸引物引入包 含期望的祀序列的DNA混合物中，随后是在DNA聚合酶存在下的精确序列的热循环。两种引