钟(40个循环）；
[0025]本发明的有益效果：
[0026] (1)本发明解决了利用传统的可培养手段直接检测酵母发酵液中是否有代谢产物 周期较长，基因不表达从而造成假阳性的结果；
[0027] (2)本发明的引物对，可以通过PCR技术实现对传统发酵食品发酵体系中产氨基甲 酸乙酯的酵母的快速检测；
[0028] (3)本发明可以获得不同种属的酵母的精氨酸酶基因序列、可快速检测酵母是否 具有产氨基甲酸乙酯潜力、可快速对酵母种属进行分类；
[0029] (4)本发明的引物，用于检测时准确性高、有效性好、灵敏性高。
【附图说明】
[0030]图1是本发明实施例的6个酵母精氨酸酶氨基酸序列比对的结果图；
[0031 ]图2是本发明实施例的PCR检测灵敏度实验结果；
[0032]图3是本发明实施例的白酒发酵体系酵母PCR扩增产物电泳分析；
[0033]图4是本发明实施例的利用简并引物检测乳酸菌的PCR扩增产物电泳分析；
[0034]图5是本发明实施例的食醋、黄酒发酵体系中酿酒酵母PCR扩增产物电泳分析； [0035]图6是本发明实施例的利用其他三对引物扩增car 1的PCR扩增产物电泳分析。
【具体实施方式】
[0036]实施例1简并引物对的设计
[0037]由于氨基酸密码子存在简并性的现象，即不同的DNA序列其最终表达的蛋白质氨 基酸序列可能是相同的，所以比对已公布的由carl编码的精氨酸酶蛋白序列，根据保守区 域设计简并引物，来检测不同种属酵母中carl基因。
[0038]从NCBI上搜集已知不同种属的6株酵母的精氨酸酶的蛋白序列，Candida parapsilosis strain CDC317(GenBank data library accession number HE605203.1, CCE40044.1)，Cyberli ndnera fabianii strain YJS4271(LK052905.1，CDR45844.1)， Saccharomyces cerevisiae S288c(NC_001148.4,NP_015214.1),Schizosaccharomyces pombe 92h(NC_003423.3,NP_595133.1),Torulaspora delbrueckii CBS 1146e (HE616742.1，XP_003679089.1)，Pichia kudriavzevii strain SD108(KGK40499.1)，进行 多序列比对之后(结果如图1所示），从保守区域144~150处设计上游引物，256~262设计下 游引物。所得引物的序列为：
[0039] 上游引物（5'43'）：。&1(^8+1~0^0：他8嫩〇吧1(呢丁~0^^?(26匕口）
[0040]
[0041] 实施例2引物对灵敏度实验
[0042] 提取Pichiaanomala酵母的基因组，稀释至lOOOng/μΙ，作为起始的模板浓度，然后 10倍比梯度稀释，稀释至lOOng/μΙ、lOng/μΙ、lng/μL、0 · lng/μL。
[0043] 本实施例所用主要试剂：引物（上海生工），2000bp DNA maker，2XTaq PCR Master Mix(with loading dye)
[0044] 本实施例所用主要仪器:基因扩增仪，电泳仪，凝胶图像分析系统
[0045] 用于检测酵母carl的简并引物灵敏度实验，具体包括以下步骤：
[0046] (1)设计与合成引物；
[0047] (2)样品DNA模板制备;包括：
[0048] a)将酵母接种YH)液体管培养24h后，离心菌体（12000rpm，2min)，加 lml ddH20洗 涤后再离心（12000印111，2111；[11);
[0049] b)细胞破碎，螺旋帽，细胞沉淀加0.2ml ddH20加0.3g玻璃珠加0.3ml PC(苯酚:氯 仿=1:1)，细胞破碎30s之后，加0.6ml超纯水，颠倒混勾之后，12000rpm，10min;
[0050] c)取上清300~400微升，加入2倍体积冰乙醇，放置于4°C冰箱静置沉淀大于2h之 后，12000rpm离心 15min;
[0051 ] d)弃上清，真空干燥，加入30μ1的ddH20。
[0052] (3)PCR扩增反应
[0053] a)使用步骤1)中简并引物，聚合酶链式反应扩增精氨酸酶基因片段，扩增使用25 微升反应体系：所述反应体系为2XTaq PCR MasterMix(with loading dye)12.5微升，两 种简并引物各〇. 5微升，酵母DNA模板1微升，加水至总体积25微升。PCR扩增条件为:94°C4分 钟，94°C 1分钟，50°C30秒，72°C 1分钟，72°C 10分钟;40个循环；
[0054] b)将PCR扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；将5微升所述扩增产物用1%琼 脂糖凝胶电泳分离，根据条带的有无和大小判定结果；
[0055]如图 2 所示，P1、P2 为起始核酸浓度 1000ngAU，P3、P4 为 100ngAU，P5、P6 为 lOng/μ 1，P7、P8为lng/yl，P9、P10为0. lng/μL。此结果说明利用该简并引物，检测灵敏度约为lng/μ 1，呈现较好的灵敏度检测。以Pichia farinosa，Clavispora lusitaniae，Hanseniaspora osmophila?Issatchenkia oriental is ?Kazachstania exigua，Pichia membranifaciens， Saccharomyces cerevisiae ? Saccharomycopsis fibuligera或者Schizosaccharomyces pombe等
【发明内容】
提及的其他种属的酵母基因组为模板，灵敏度也约在lng/μL。
[0056]实施例3引物对的检测有效性、准确性实验
[0057] (1)取15株已经通过HPLC方法检测到产氨基甲酸乙酯的酵母菌株dssatchenkia orientalis(来自清香型白酒）；Saccharomy cop s is fibuligera(清香型白酒）； Saccharomyces cerevisiae (清香型白酒）；Saccharomyces cere vis iae(芝麻香型白酒）； Pichia membranifaciens (酱香型白酒）；Issatchenkia oriental is (芝麻香型白酒）； Pichia anomala(浓香型白酒）；Pichia anomala(芝麻香型白酒）；Issatchenkia orientalis(浓香型白酒）；Saccharomycopsis fibuligera(清香型白酒）； Schizosaccharomyces pombe (清香型白酒）；Kazachstania exigua(清香型白酒）； Han sen i asp ora osmophi la (清香型白酒）；Pichia membranifaciens (清香型白酒）； Clavispora lusitaniae(清香型白酒）。
[0058]分开提取上述15株菌的各自基因组。
[0059] 使用如SEQ ID NO. 1所示和SEQ ID Ν0.2所示的序列组成的引物对，对各基因组进 行PCR，然后电泳检测。
[0060]结果发现:PCR产物在330bp左右的范围内具有条带(如图3所示），说明使用该引物 确实能够扩增得到不同种属酵母的精氨酸酶基因。
[0061] 然后PCR产物进行测序并将测序结果在NCBI上进行比对，结果发现NCBI上比对到 的酵母种属名称与实际用到的酵母种属相一致，说明该引物确实能够实现产氨基甲酸乙酯 的酵母种属的鉴定。
[0062] (2)取5株已经确认没有精氨酸酶基因的菌株（Lactobacillus buchneri， Lactobacillus diolivorans,Lactobacillus casei ,Pediococcus parvulus , Lactobacillus plantarum.，均来自白酒发酵体系），各自提取基因组，然后使用本发明的 引物对(SEQ ID NO. 1/SEQ ID N0.2)进行PCL结果发现没有条带或者是没有相应大小的条 带(如图4所示）。说明本发明的引物对特异性好、检测准确性好，不会导致对未含有精氨酸 酶基因的菌株出现假阳性判定。
[0063]实施例4白酒发酵体系酵母carl检测
[0064] 从白酒发酵体系中筛选得到了15株酵母，包括Issatchenkia orientalis(清香型 白酒）；Saccharomycopsis fibuligera(清香型白酒）；Saccharomyces cerevisiae(清香型 白酒）；Saccharomyces cerevisiae(；Pichia membranifaciensC^^? Q 酒）；Issatchenkia orientalis(芝麻香型白酒）；Pichia anomala(浓香型白酒）；Pichia anomala(芝麻香型白酒）；Issatchenkia oriental is (浓香型白酒）；Saccharomycopsis fibuligera (浓香型白酒）；Schizosaccharomyces pombe (浓香型白酒）；Kazachstania exigua(清香型白酒）；Hansenia spora osmophila(清香型白酒）；Pichia membranifaciens(清香型白酒）；Clavispora lusit aniae(清香型白酒）。
[0065] 本实施例所用主要试剂：引物（上海生工），2000bp DNA maker，2XTaq PCR Master Mix(with loading dye)
[0066] 本实施例所用主要仪器:基因扩增仪，电泳仪，凝胶图像分析系统 [0067]利用PCR快速检测上述酵母是否产氨基甲酸乙酯，具体包括以下步骤：
[0068] (1)设计与合成引物:序列如SEQ ID NO. 1所示和SEQ ID N0.2所示；
[0069] (2)样品DNA模板制备;包括：
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