一种快速鉴定产氨基甲酸乙酯酵母的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速鉴定产氨基甲酸乙酯酵母的方法，属于生物技术及食品安全 领域。
【背景技术】
[0002] 氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，简称EC)是一种潜在的多位点致癌物，广泛存在 于多种发酵食品和酒精饮料中，如面包、白酒、酱油等。形成EC的前体物质主要有瓜氨酸、尿 素、氰化物以及氨甲酰磷酸，他们能自发与乙醇发生化学反应形成EC。其中，尿素是形成EC 的最重要的前体物质。在发酵过程中，尿素主要是是由酵母代谢精氨酸所产生。在酵母的精 氨酸代谢途径中，carl编码精氨酸酶，是该途径中的第一个酶，参与精氨酸的分解代谢形成 尿素。
[0003] 在酵母中，编码精氨酸酶的carl呈现出多样性，而目前大量的报道集中于酿酒酵 母。传统食品发酵过程中由多种酵母共同参与，如pichia，Candida，Saccharomyces等。目前 所报道的carl序列不多，由已知的公开的carl序列比对发现，在不同酵母种属中序列差异 很大，以至于目前还没有一种引物能同时检测不同酵母的carl基因。
[0004] 我国发酵食品种类繁多，而我国对发酵食品中EC的研究主要集中在检测方面。当 前迫切需要跟踪我国各类发酵食品的发酵过程，对EC的形成机制作深入研究。为了深入了 解发酵食品发中能产EC的酵母，有必要建立起一种快速鉴定产EC酵母的方法，为之后进一 步用微生物手段控制发酵食品中氨基甲酸乙酯形成提供了思路。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述问题，本发明提供了一种用于产氨基甲酸乙酯酵母快速检测的引物 及其应用。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种可快速检测酵母是否具有产氨基甲酸乙酯潜力 或者可快速对酵母种属进行分类的引物对，所述引物对：
[0007] (1)由核苷酸序列为NCCNCCNBBNACNSKNGTNCCNGTNG(如SEQ ID N0.1 所示）和核苷 酸序列为TGGWTNGAYGCNCAYGCNGAYATHAA(如SEQ ID N0.2所示）的核苷酸片段组成;或者是
[0008] (2)由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸 片段组成。
[0009] 本发明的第二个目的是提供所述引物对在检测样品中是否存在具有产氨基甲酸 乙酯潜力的酵母的应用。
[0010]在本发明的一种实施方式中，所述样品是来自任意含有酵母的发酵食品体系的样 品，或者是从发酵食品体系中筛选得到的酵母的菌落、发酵液、菌体，或者是含有酵母基因 组的样品。
[0011]在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品体系所指的发酵食品是白酒、黄酒、食 醋、泡菜、酱油、酸奶、干酪、酒酿、豆豉、乳腐、黄酒、啤酒、葡萄酒中的任意一种。优选的发酵 食品体系为白酒发酵体系、黄酒发酵体系或食醋发酵体系。
[0012]在本发明的一种实施方式中，所述酵母是以下任意一种或者多种：Pichia farinosa，Clavispora lusitaniae，Hanseniaspora osmophila，Issatchenkia oriental is，Kazachstania exigua，Pichia anomala，Pichia membranifaciens， Saccharomyces cerevisiae，Saccharomycopsis f ibuligera、Schizosaccharomyces pombe、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Steri gmatomyces e1viae、 Zygosaccharomyces bailii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichia galeiformis、Pichia fabianii、Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae^Cryptococcus neoformans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、 Brettanomyces custersianus^Debaryomyces hansenii或者Candida apicola〇 [0013]在本发明的一种实施方式中，所述酵母，来自白酒发酵体系，包括Saccharomyces cerevi siae(来自清香型或芝麻香型白酒）、Pichia farinosa(清香型白酒）、 Saccharomycopsis fib uligera(清香型白酒）、Clavispora lusitaniae(清香型白酒）、 Issatchenkia orientalis(清香型或芝麻香型白酒）、Pichia membranifaciens(清香型或 酱香型白酒）、Pichia anomala(芝麻香型白酒）、Hanseniaspora osmophila(清香型白酒）、 Schizosaccharomyces pombe(浓香型白酒）。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述具有产氨基甲酸乙酯潜力的酵母是指含有精氨 酸酶编码基因的酵母。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述检测是指利用引物对进行PCR，如果PCR产物检 狈L显示具有250-500bp之间（具体是在330bp左右）的片段，则代表该酵母具有carl基因，即 该酵母具有产生氨基甲酸乙酯的潜能。PCR产物如果不在250-500bp之间（具体是330bp左 右)或者没有条带，则代表该酵母不具有carl基因，也就不具备产氨基甲酸乙酯的潜能。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述PCR是先提取样品的基因组再进行PCR或者直接 对酵母菌液进行PCR;
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述PCR扩增使用25微升反应体系:所述反应体系为 2XTaq PCR MasterMix(with loading dye)12.5微升，两种简并引物各0.5微升，酵母DNA 模板1微升，加水至总体积25微升;PCR扩增的条件为:94°C4分钟，94°C1分钟，50°C30秒，72 °C1分钟，72°C10分钟(40个循环）；
[0018] 本发明的第三个目的是提供一种快速检测酵母种属的方法，所述方法是使用所述 的SEQ ID N0.1和SEQ ID勵.2的引物对对含有酵母基因组的样品进行?0?，将得到的？0?产 物的序列在NCBI上进行比对，从而得知酵母的属种。
[0019] 所述酵母是以下任意一种或者多种:Pichia farinosa，Clavispora lusitaniae， Hanseniaspora osmophila，Issatchenkia orientalis，Kazachstania exigua，Pichia anomala，Pichia membranifaciens，Saccharomyces cerevisiae，Saccharomycopsis f ibul igera或者Schizosaccharomyces pombe、Schizosaccharomyces pombe、Pi chia fermentans、Trichosporon asahi i > Sterigmatomyces elviae、Zygosaccharomyces bailii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichia galeiformis、Pichia fabianii、 Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae、Cryptococcus neof ormans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、Brettanomyces custersianus、Debaryomyces hansenii或者Candida apicola。
[0020] 本发明的第四个目的是提供所述的SEQIDN0.1/SEQIDN0.2的引物对或SEQID NO. 1/SEQ ID NO.2同时反向互补得到的引物对在宏基因组方面的应用。所述应用，是用所 述引物对进行含有宏基因组的样品的PCR，通过PCR结果判定样品中是否含有具有产氨基甲 酸乙酯潜力的酵母(如果PCR产物检测，显示具有330bp左右的片段，则代表该宏基因组中有 carl的存在，即该环境样品中存在产氨基甲酸乙酯酵母的存在；PCR产物如果不在250-500bp(具体是在330bp左右）范围或者没有条带，该宏基因组中没有carl的存在，即该环境 样品中不存在产氨基甲酸乙酯酵母），和/或根据PCR产物的测序结果判定酵母的属种。
[0021] 本发明的第五个目的是提供所述的SEQIDN0.1/SEQIDN0.2的引物对或SEQID NO. 1/SEQ ID N0.2同时反向互补得到的引物对在DGGE分析微生物方面的应用。所述应用， 是用所述引物对进行含有微生物基因组的样品的PCR，通过PCR结果判定样品中是否含有具 有产氨基甲酸乙酯潜力的酵母，和/或根据PCR产物的测序序列在在NCBI上的比对结果判定 酵母的属种。
[0022] 本发明的第六个目的是提供一种获得不同种属的酵母的精氨酸酶基因序列的方 法，是使用所述的SEQIDN0.1/SEQIDN0.2的引物对或SEQIDN0.1/SEQIDN0.2同时反 向互补得到的引物对对酵母基因组进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序(或者进一步根 据PCR测序结果设计引物对扩增产物的上下游序列进行扩增，进而得到全长的精氨酸酶基 因序列），即得到精氨酸酶基因序列。
[0023] 在本发明中，使用SEQ ID N0.1/SEQ ID勵.2的引物对样品进行?0?时，引物对的 各引物的浓度为lOngAU-lOOOngAU。
[0024]在本发明中，使用SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2的引物对（或SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO.2同时反向互补得到的引物对)样品进行PCR时，PCR扩增使用25微升反应体系:所述反应 体系为2XTaq PCRMasterMix(with loading dye)12.5微升，两种简并引物各0.5微升，酵 母DNA模板1微升，加水至总体积25微升;PCR扩增的条件为:94°C4分钟，94°C 1分钟，50°C30 秒，72°C 1分钟，72°C 10分