070] a)将酵母接种YH)液体管培养24h后，离心菌体（12000rpm，2min)，加 lml ddH20洗 涤后再离心（12000印111，2111；[11);
[0071] b)细胞破碎，螺旋帽，细胞沉淀加0.2ml ddH20加0.3g玻璃珠加0.3ml PC(苯酚:氯 仿=1:1)，细胞破碎30s之后，加0.6ml超纯水，颠倒混勾之后，12000rpm，10min
[0072] c)取上清300~400微升，加入2倍体积冰乙醇，放置于4°C冰箱静置沉淀大于2h之 后，12000rpm离心 15min;
[0073] d)弃上清，真空干燥，加入30μ1的ddH20;
[0074] (3)PCR扩增反应
[0075] a)使用步骤1)中简并引物，聚合酶链式反应扩增过精氨酸酶基因片段，扩增使用 25微升反应体系：所述反应体系为2XTaq PCR MasterMix(with loading dye)12.5微升， 两种简并引物各〇. 5微升，酵母DNA模板1微升，加水至总体积25微升。PCR扩增条件为:94°C4 分钟，94°C1分钟，50°C30秒，72°C1分钟，72°C10分钟。40个循环；
[0076] b)将PCR扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；将5微升所述扩增产物用1%琼 脂糖凝胶电泳分离，根据条带的有无和大小判定结果；
[0077] c)对PCR扩增产物进行DNA测序，获得不同种属酵母的精氨酸酶基因的序列；
[0078]将5μ1产物用琼脂糖电泳分离，电泳结果如图3所不，Μ为maker，1-15分别为
[0079] 1 为Issatchenkia orientalis(清香型白酒）；2为Saccharomycopsis fibuligera (清香型白酒）；3为Saccharomyces cerevisiae(清香型白酒）；4为 Saccharomyces cerevisiae(芝麻香型白酒）；5为Pichia membranifaciens(酱香型白酒）；6为 Issatchenkia orientalis(芝麻香型白酒）；7为Pichia anomala(浓香型白酒）；8为Pichia anomala(芝麻香型白酒）；9为Issatchenkia orientalis(浓香型白酒）；10为 Saccharomycopsis fibuligera(浓香型白酒）；11 为Schizosaccharomyces pombe(浓香型 白酒）；12为Kazachstania exigua(清香型白酒）；13为Hanseniaspora osmophila(清香型 白酒）；14为Pichia membranifaciens(清香型白酒）；15为Clavispora lusitaniae(清香型 白酒）。
[0080] 这说明从白酒发酵体系当中筛选的这15株酵母均具有carl基因，都具有产氨基甲 酸乙酯的潜能。经液体培养，HPLC检测发酵液中，均有尿素的存在，并且尿素的产量差异很 大。白酒发酵过程中会不可避免地产生氨基甲酸乙酯，为降低白酒中EC的含量提供了生物 学的方法。
[0081] 实施例5黄酒、食醋发酵体系酿酒酵母carl检测
[0082] 采用与实施例4类似的方法，对从黄酒或食醋发酵体系中筛选得到的酵母进行 PCR〇
[0083] 将5μ 1产物用琼脂糖电泳分离，电泳结果如图5所示，M为maker，1 -3分别为 Saccharomyces cerevisiae(黄酒发酵体系），Saccharomyces cerevisiae(食醋发酵体 系），Saccharomyces cerevisiae(白酒发酵体系）。结果说明本发明的引物可以实现对不同 发酵体系来源的酵母进行检测;此处均检测到carl基因，还说明精氨酸酶在相同物种当中 差异不大。
[0084] 实施例6引物序列对检测有效性、准确性的影响
[0085] 本发明还采用类似的设计，设计了其他3对引物。然后采用与实施例3-致的方法， 对与实施例3相同的15株菌进行PCR扩增。结果如图6所示。结果表明，其他的引物扩增效果 显著不如实施例3的序列为SEQ ID NO. 1/SEQ ID N0.2的引物对。
[0086] 引物信息如下：
[0087] (1)引物对1:(结果如图6A)
[0088] F1:RTNGAYGCNCAYGCNGAYAT 144~150(序列如SEQ ID N0.3)
[0089] R1:TCNANRTCNCKNARNCCDAT 1"~2〇5(序列如SEQ ID N0.4)
[0090] (2)引物对2:(结果如图6B)
[0091] F2:RRNAAYYTNCAYGGNTGYCC 160~166(序列如SEQ ID N0.5)
[0092] RINGGRTCNMHNSCRTCNACRT 256~262(序列如SEQ ID NO·6)
[0093] (3)引物对3:(结果如图6C)
[0094] F3:RTNGAYGCNCAYGCNGAYAT 144~150(序列如SEQ ID N0.7)
[0095] R3:NGGRTCNMHNSCRTCNACRT 256~262(序列如SEQ ID N0.8)
[0096] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种引物对，其特征在于，所述引物对由核苷酸序列为SEQ ID NO.1和核苷酸序列为 SEQ ID NO.2的核苷酸片段组成，或者是由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2的序列同时进行反 向互补后得到的两个核苷酸片段组成。2. 权利要求1所述引物对在检测样品中是否存在具有产氨基甲酸乙酯潜力的酵母的应 用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样品是来自任意含有酵母的发酵食品 体系的样品，或者是从发酵食品体系中筛选得到的酵母的菌落、发酵液、菌体样品，或者是 含有酵母基因组的样品。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵食品体系所指的发酵食品是白 酒、黄酒、食醋、泡菜、酱油、酸奶、干酪、酒酿、豆豉、乳腐、黄酒、啤酒、葡萄酒中的任意一种。5. 根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于，所述酵母是以下任意一种或者多 种：Pichia farinosa、Clavispora lusitaniae、Hanseniaspora osmophila、Issatchenkia orientalis、Kazachstania exigua、Pichia anomala、Pichia membranifaciens、 Saccharomyces cerevisiae、Saccharomycopsis fibuligera、Schizosaccharomyces pombe、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Sterigmatomyces elviae、 Zygosaccharomyces bai1ii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichia galeiformis、Pichia fabianii、Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyeraeNCryptococcus neoformans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、 Brettanomyces custersianus、Debaryomyces hansenii或者Candida apicola。6. -种快速检测酵母种属的方法，所述方法是使用权利要求1所述的引物对含有酵母 基因组的样品进行PCR，将得到的PCR产物的序列在NCBI上进行比对，从而得知酵母的属种。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酵母是以下任意一种或者多种： Pichia farinosa、Clavispora lusitaniae、Hanseniaspora osmophila、Issatchenkia orientalis、Kazachstania exigua、Pichia anomala、Pichia membranifaciens、 Saccharomyces cerevisiae、Saccharomycopsis fibuligera、Schizosaccharomyces pombe、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Sterigmatomyces elviae、 Zygosaccharomyces bai1ii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichia galeiformis、Pichia fabianii、Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyeraeNCryptococcus neoformans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、 Brettanomyces custersianus、Debaryomyces hansenii或者Candida apicola。8. 权利要求1所述的引物对在宏基因组方面的应用。9. 权利要求1所述的引物对在DGGE分析微生物方面的应用。10. -种获得酵母的精氨酸酶基因序列的方法，其特征在于，所述方法是使用权利要求 1所述的引物对进行PCR扩增。
【专利摘要】本发明公开了一种快速鉴定产氨基甲酸乙酯酵母的方法，属于生物技术及食品安全领域。本发明以酵母的精氨酸酶保守区域设计简并引物，快速鉴定产氨基甲酸乙酯(EC)的酵母。通过聚合酶链式反应(PCR)，快速检测酵母是否具有产EC的潜能。该方法是一种快速、准确、使用简并引物检测产EC的酵母，可应用于传统发酵食品中产EC酵母的鉴定。
【IPC分类】C12N15/10, C12N15/11, C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN105524921
【申请号】CN201610072362
【发明人】吴群, 徐岩, 林建春
【申请人】江南大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月2日