处理，Qifflinks vl.0.3将RNA-seq片 段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定 基因化b长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。 Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载（Homo_ sapiens.GRQi37.63.gtf)。
[0072] 3.3差异表达基因的检测
[007引将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表 达。在化ffi壯f输出中只有q值<0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
[0074] 4、结果
[00巧]RNA-seq结果显示，KIAA022化基因在I型糖尿病患者血液中的表达量显著高于正 常人的表达量。
[0076] 实施例2 QPCR测序验证KIAA022化基因的差异表达
[0077] 1、根据高通量测序的检测结果选择KIAA0226L基因进行大样本QPCR验证。按照实 施例1中的样本收集方式选择I型糖尿病患者血液和正常人血液各70例。
[007引 2、RNA提取步骤同实施例1。
[0079] 3、逆转录:使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
[0080] (1)取总RNA 2yg进行逆转录，加入01 igo(dT)2μ1，充分混匀；70°C水浴;5min后立 即冰浴2-3min;
[0081 ] (2)构建25μ1反应体系，其中包括5X逆转录缓冲液扣l，dNTP(2.5mM)5yl，RNasin 4〇υ/μ1，M-MLV 20〇υ/μ1，补无核酶水至25μ1;
[0082] (3) 42°C 水浴 60min 后，95°C 水浴 5min W 灭活 M-MLV，-20°C 储存备用。
[0083] 4、QPCR 扩增
[0084] (1)引物设计
[0085] 根据Genebank中KIAA0226L基因和管家基因 GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增 引物，由上海博尚生物技术有限公司合成。其中KIAA022化基因的引物对序列如下：正向引 物序列为5'-了4了41^46〔44了664644-3'（569 10^.3);反向引物序列为5'- TGTATGAAGAAGTAGAAGA-3'（沈Q ID NO.4) dGAPDH基因的引物序列对如下：正向引物序列为 5'-(：1'(：了66了4446了664了41'了61'-3'（569 10則.5);反向引物序列为5'- GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)。
[0086] (2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各lyl，SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.化1，模板化1，加去离子水补足至25μ1。
[0087] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[008引（3)PCR反应条件：95°C10min，（95°C15s，60°C60s)X30个循环。WSY服 Green作为 巧光标记物，在Li曲t切cler巧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确 定目的条带，Δ Δ CT法进行相对定量。
[0089] 5、统计学方法
[0090] 实验采用3次重复实验，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示，使用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统 计学意义。
[0091] 6、结果
[0092] 结果如图1所示，与正常人血液相比，KIAA022化基因在I型糖尿病患者血液中的表 达上调，差异具有统计学意义(P<〇. 05)，同RNA-S巧结果一致。
[0093] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. KIAA0226L基因在制备诊断I型糖尿病产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括:通过实时定量PCR、RT-PCR、 免疫检测、原位杂交或芯片检测KIAA0226L基因的表达水平以诊断I型糖尿病的产品。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断I型糖尿病的产品 至少包括一对特异扩增KIAA0226L基因的引物;所述用RT-PCR诊断I型糖尿病的产品至少包 括一对特异扩增KIAA0226L基因的引物；所述用免疫检测诊断I型糖尿病的产品包括：与 KIAA0226L蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断I型糖尿病的产品包括：与 KIAA0226L基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断I型糖尿病的产品包括:蛋白芯片 和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KIAA0226L蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与 KIAA0226L基因的核酸序列杂交的探针。4. 根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片和/或试剂盒； 其中所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检 测试剂盒。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因检测试剂盒包括SYBR Green聚合 酶链式反应体系、用于扩增KIAA0226L基因和管家基因的引物对;所述SYBR Green聚合酶链 式反应体系包含:PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。6. -种诊断I型糖尿病的产品，其特征在于，所述的产品能够通过检测KIAA0226L基因 的表达水平来诊断I型糖尿病。7. 根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒;其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核 苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KIAA0226L基因转录水平的针对KIAA0226L基因 的暴核昔酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KIAA0226L蛋白的 特异性抗体;所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂 盒包括用于检测KIAA0226L基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括KIAA0226L 蛋白的特异性抗体。8. 根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述检测KIAA0226L基因转录水平的试剂 包括针对KIAA0226L基因的引物和/或探针。9. 根据权利要求7或8所述的产品，其特征在于，所述基因检测试剂盒包含SYBR Green 聚合酶链式反应体系、用于扩增KIAA0226L基因和管家基因的引物对;所述SYBR Green聚合 酶链式反应体系包含:PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。10. 根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述扩增KIAA0226L基因的引物对序列如 下：正向引物序列为5'-TATATCAGCAATGGAGAA-3' ；反向引物序列为5'-TGTATGAAGAAGTAGAAGA-3' ；所述管家基因为GAPDH，扩增GATOH的引物序列对如下：正向引物 序列为5 ' -CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3 ' ；反向引物序列为5 ' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3 '。
【专利摘要】本发明公开了一种I型糖尿病的分子标志物，KIAA0226L基因在I型糖尿病患者的血液中表达上调，通过检测KIAA0226L基因的表达水平可以为I型糖尿病患者提供早期诊断，从而实现早发现早治疗，降低I型糖尿病患者的死亡率。
【IPC分类】C12Q1/68, G01N33/68
【公开号】CN105543400
【申请号】CN201610111924
【发明人】宋宏涛, 肖枫
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月29日