Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法和使用了该蛋白质的抗体吸附剂、以及使用了该吸 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及对免疫球蛋白具有亲和性的Fc结合性蛋白质、使用了该蛋白质的抗体 吸附剂、W及使用了该吸附剂的抗体的纯化方法和识别方法。更详细而言，本发明设及对 热、酸的稳定性高于野生型的化结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法W及将该蛋白质固定 化于不溶性载体而得到的抗体吸附剂。特别是，本发明设及能够特异地吸附抗体中具有糖 链的抗体的吸附剂、W及使用了该吸附剂的、具有糖链的抗体的纯化方法W及识别糖链有 无附加于抗体的方法。
【背景技术】
[0002] 化受体是与免疫球蛋白分子的化区域结合的一组分子。各个分子通过属于免疫球 蛋白超家族的识别结构域，利用Fc受体上的识别结构域识别单一或相同组的免疫球蛋白同 种型。由此决定免疫应答中何种辅助细胞起作用。Fc受体可进一步分类成几种亚型，有IgG (免疫球蛋白G)的受体即化丫受体、与I巧的化区域结合的Fee受体、与IgA的化区域结合的 Fca受体等。另外，各受体更详细地分类，Fc 丫受体有Fc 丫 RI、Fc 丫 RIIa、Fc 丫 Rllb和Fc 丫 RlllaJc 丫 Rinb 的存在被报导（非专利文献 l:Takai.T. Jpn.J.Clin. Immunol. ,28,318- 326,2005)〇
[0003] Fc 丫受体中Jc 丫 Rllla存在于自然杀伤细胞(NK细胞）、巨隧细胞等细胞表面，是 人免疫机构中参与十分重要的ADCC(抗体依赖性细胞损伤)活性的重要的受体。有报导称， 该Fc 丫 Rllla与人IgG的亲和性为表示结合强度的结合常数化A)为107M-1W下(非专利文献 2 :J. Galon 等，Eur.J. Immunol.，27,1928-1932,1997)。人 Fc 丫 Rllla 的氨基酸序列（序列号 1)被UniP;rot(Accession number :P08637)等公共数据库发布。另外，对于人Fc 丫 Rllla的结 构上的功能结构域、用于贯穿细胞膜的信号肤序列、细胞膜贯穿区域的位置，也同样被发 布。图1表示人化丫 Rllla的结构示意图。需要说明的是，图1中的氨基酸号对应于序列号1中 记载的氨基酸号。即，序列号1中的第1位的甲硫氨酸(Met)至第16位的丙氨酸(Ala)为止为 信号序列（S);第17位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为细胞外区域化C); 第209位的鄉氨酸(Val)至第229位的鄉氨酸(化1)为止为细胞膜贯穿区域(TM)W及第230位 的赖氨酸化ys)至第254位的赖氨酸化ys)为止为细胞内区域(C)。需要说明的是，已知化丫 Rllla与IgGl至IgG4的人IgG亚类中特别是IgGl和IgG3强结合、而与IgG2和IgG4的结合弱。
[0004] 另一方面，近年来，利用单克隆抗体所具有的特异性的药物(抗体药物）的开发有 所进展。已知，报导了在抗体药物中所使用的人IgG中，根据化区域的第297位的天冬酷胺残 基上附加的N型糖链的差异，ADCC(抗体依赖性细胞损伤)活性变化，特别是用去除了作为糖 链的一种的岩藻糖的抗体，ADCC活性提高（非专利文献3: Shinkawa. T.，J. Biol. Chem.，278， 3466-3473,2003)。即，抗体药物中，抗体所具有的糖链结构具有重要的意义。然而，抗体药 物通常是使用W动物细胞作为宿主的基因重组技术而制造的，难W控制在宿主内附加于抗 体的糖链。另外，对制造的抗体的糖链进行分析需要很多时间和劳力。
[0005] 现有技术文献
[0006] 非专利文献
[0007] 非专利文献l:Takai.T. Jpn.J.Clin. Immunol.，28,318-326,2005 [000引 非专利文献2: J.Galon等，Eur. J. Immunol.，27，1928-1932，1997
[0009] 非专利文献3:aii址awa.T. J.Biol.Chem.，278，：M66-3473,2003
【发明内容】
[0010] 发明要解决的问题
[0011] 本发明的第一课题在于提供特别是对热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、 该蛋白质的制造方法、W及使用了该蛋白质的抗体吸附剂。进而，本发明的第二课题在于提 供能够识别对于抗体有无附加糖链的方法W及该方法中使用的材料。
[00。] 用于解决问题的方案
[0013] 本发明人等为了解决上述第一课题进行了深入研究的结果发现，确定了人Fc 丫 Rllla中的设及稳定性提高的氨基酸残基，并且将该氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基 的突变体具有对热、酸优异的稳定性，至此完成了本发明。
[0014] 本发明人等为了解决上述的第二课题进行了深入研究的结果发现，通过使用将 IgG受体(化丫受体)之一的Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的吸附剂，能够识别有无 糖链附加于抗体，至此完成了本发明。
[0015] 旨P，本发明包含W下的(A)至(Z)中所述的方式：
[0016] (A)-种Fc结合性蛋白质，其包含序列号1中记载的氨基酸序列中由第17位至第 192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生W下的（1)至 (40)中至少任一种氨基酸置换；
[0017] (1)序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸
[0018] (2)序列号1的第27位的鄉氨酸置换为谷氨酸
[0019] (3)序列号1的第29位的苯丙氨酸置换为亮氨酸或丝氨酸
[0020] (4)序列号1的第30位的亮氨酸置换为谷氨酷胺
[0021] (5)序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酷 胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的任一者
[0022] (6)序列号1的第46位的赖氨酸置换为异亮氨酸或苏氨酸
[0023] (7)序列号1的第48位的谷氨酷胺置换为组氨酸或亮氨酸
[0024] (8)序列号1的第50位的丙氨酸置换为组氨酸
[0025] (9)序列号1的第51位的酪氨酸置换为天冬氨酸或组氨酸
[0026] (10)序列号1的第54位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸
[0027] (11)序列号1的第56位的天冬酷胺置换为苏氨酸
[0028] (12)序列号1的第59位的谷氨酷胺置换为精氨酸
[0029] (13)序列号1的第61位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
[0030] (14)序列号1的第64位的谷氨酸置换为天冬氨酸
[0031] (15)序列号1的第65位的丝氨酸置换为精氨酸
[0032] (16)序列号1的第71位的丙氨酸置换为天冬氨酸
[0033] (17)序列号1的第75位的苯丙氨酸置换为亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸的任一者
[0034] (18)序列号1的第77位的天冬氨酸置换为天冬酷胺
[0035] (19)序列号1的第78位的丙氨酸置换为丝氨酸
[0036] (20)序列号1的第82位的天冬氨酸置换为谷氨酸或鄉氨酸
[0037] (21)序列号1的第90位的谷氨酷胺置换为精氨酸
[0038] (22)序列号1的第92位的天冬酷胺置换为丝氨酸
[0039] (23)序列号1的第93位的亮氨酸置换为精氨酸或甲硫氨酸
[0040] (24)序列号1的第95位的苏氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸
[0041] (25)序列号1的第110位的亮氨酸置换为谷氨酷胺
[0042] (26)序列号1的第115位的精氨酸置换为谷氨酷胺
[0043] (27)序列号1的第116位的色氨酸置换为亮氨酸
[0044] (28)序列号1的第118位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
[0045] (29)序列号1的第119位的赖氨酸置换为谷氨酸
[0046] (30)序列号1的第120位的谷氨酸置换为鄉氨酸
[0047] (31)序列号1的第121位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸
[0048] (32)序列号1的第151位的苯丙氨酸置换为丝氨酸或酪氨酸
[0049] (33)序列号1的第155位的丝氨酸置换为苏氨酸
[0050] (34)序列号1的第163位的苏氨酸置换为丝氨酸
[0051] (35)序列号1的第167位的丝氨酸置换为甘氨酸
[0052] (36)序列号1的第169位的丝氨酸置换为甘氨酸
[0053] (37)序列号1的第171位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
[0054] (38)序列号1的第180位的天冬酷胺置换为赖氨酸、丝氨酸、异亮氨酸的任一者
[0055] (39)序列号1的第185位的苏氨酸置换为丝氨酸
[0056] (40)序列号1的第192位的谷氨酷胺置换为赖氨酸。
[0057] (B)根据(A)所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第 17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序列 号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酷胺、脯氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、组氨酸的任一者。
[005引（C)根据(B)所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第 17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序列 号1的第35位的酪氨酸置换为天冬酷胺或脯氨酸。
[0059] (D)根据(C)所述的化结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列中由第33位 至第208位为止的氨基酸残基。
[0060] 化)根据(D)所述的化结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列。
[0061] (F)根据(A)至（C)的任一项所述的Fc结合性蛋白质，进一步产生W下的（41)至 (44)中至少任一个氨基酸置换；
[0062] (41)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸
[0063] (42)序列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸
[0064] (43)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨酸
[0065] (44)序列号1的第176位的鄉氨酸置换为苯丙氨酸
[0066] (G)-种吸附剂，其是将(A)至(F)的任一项所述的化结合性蛋白质固定化于不溶 性载体而得到的。
[0067] 化)一种抗体的纯化方法，其使用了 (G)所述的吸附剂。
[0068] (I)-种识别方法，使用(G)所述的吸附剂分离抗体，从而识别抗体所具有的糖链 结构的差异。
[0069] (J) -种抗体，其是用化)所述的纯化方法得到的。
[0070] 化)一种糖链的分离方法，其使用了 (G)所述的吸附剂。
[0071] (L) -种糖链，其是用化)所述的分离方法得到的。
[0072] (M)-种多聚核巧酸，其编码(A)至(F)的任一项所述的化结合性蛋白质。
[0073] (N)-种表达载体，其包含(M)所述的多聚核巧酸。
[0074] (0)-种转化体，其是W(N)所述的表达载体转化宿主而得到的。
[0075] (P)根据(0)所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。
[0076] (Q)-种化结合性蛋白质的制造方法，通过对(0)或(P)所述的转化体进行培养而 使Fc结合性蛋白质表达，从该培养物中回收表达的Fc结合性蛋白质。
[0077] (R) -种具有糖链的抗体的吸附剂，其是将人Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得 到的。
[007引（S)根据(R)所述的吸附剂，其中，人化丫 Rllla为包含序列号1中记载的氨基酸序 列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基的多肤。
[0079] (T)根据(R)所述的吸附剂，其中，人化丫 Rllla为包含序列号1中记载的氨基酸序 列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基，并且前述氨基酸残基 中的一个W上被其他的氨基酸残基置换、插入、或缺失了前述氨基酸残基中的一个W上的 多肤。
[0080] (U)根据(T)所述的吸附剂，其中，人化丫 Rllla为包含序列号1中记载的氨基酸序 列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基并且该第17位至第192 位为止的氨基酸残基中产生了 W下（i)至(iv)中至少任一种氨基酸置换的多肤。
[0081] (i)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸
[0082] (ii)序列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸
[0083] (iii)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨酸
[0084] (iv)序列号1的第176位的鄉氨酸置换为苯丙氨酸
[0085] (V)-种具有糖链的抗体的纯化方法，其包括:将包含具有糖链的抗体的溶液添加 至(R)至化)的任一项所述的吸附剂中并使具有糖链的抗体吸附于该吸附剂的工序;和、使 用洗脱液将吸附于前述吸附剂的具有糖链的抗体洗脱的工序。
[0086] (W)-种抗体，其是用(V)所述的纯化方法得到的。
[0087] (X)-种识别方法，使用(R)至(U)的任一项所述的吸附剂来识别有无糖链附加于 抗体。
[0088] (Υ)-种糖链的分离方法，其使用了 (R)至化)的任一项所述的吸附剂。
[0089] (Z)-种糖链，其是用(Y)所述的分离方法得到的。
[0090] W下，对本发明详细地进行说明。
[0091] 本发明的Fc结合性蛋白质是具有与抗体的Fc区域的结合性的蛋白质，是包含含有 序列号1中记载的氨基酸序列的人Fc 丫 Rllla的细胞外区域(图1的EC的区域)中至少第17位 的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基的蛋白质，是该第17位至第192位为止的 氨基酸残基中的特定位点产生了氨基酸置换的蛋白质。因此，本发明的化结合性蛋白质可 W包含位于细胞外区域的N末端侧的信号肤区域（图1的S)的全部或者一部分，也可W包含 位于细胞外区域的C末端侧的细胞膜贯穿区域（图1的TM)和细胞外区域（图1的C)的全部或 者一部分。前述特定位点中的氨基酸置换具体而言，是指序列号1中记载的氨基酸序列中下 述至少任一种置换:MetlSArg(该标记表示序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸，W 下相同）、Val27Glu、Phe29Leu、F*he29Se;r、Leu30Gln、Tyr35Asp、Tyr35Gly、Tyr35Lys、 Tyr35Leu、Tyr35Asn、Tyr35Pro、Tyr35Ser、Tyr35Thr、Tyr35His、Lys46Ile、Lys46Thr、 Gln48His、Gln48Leu、Ala50His、Tyr51Asp、Tyr51His、Glu54Asp、Glu54Gly、Asn56Thr、 Gln59Arg、Phe61Tyr、Glu64Asp、Ser65Arg、Ala71Asp、Phe75Leu、Phe75Ser、Phe75Tyr、 Asp77Asn、Ala78Se;r、Asp82Glu、Asp82Val、Gln90Arg、Asn92Se;r、Leu93Arg、Leu93Met、 Thr95Ala、Thr95Ser、LeullOGln、Argl15Gln、Trpl16Leu、Phell8Tyr、Lysl19Glu、 Glul20Val、Glul21Asp、Glul21Gly、Phel51Ser、Phel51Tyr、Serl55Thr、Thrl63Ser、 Se;rl67Gly、Se;rl69Gly、Phel71Ty;r、Asnl80Lys 'AsnlSOSer'AsnISOIle'ThrlSSSer、 61]11921^73。其中，产生了7的5439、了7扣5617、了7的化73、了7'351^611、了7'3543]1、了7'35口1'〇、 了7^556'、了7扣5化'、了7^5化3、6111121617中任一置换时，热稳定性提高，因而优选。另外， 已知野生型人Fc 丫 Rllla中有产生了Leu66His、Leu66Arg、Glyl47Asp、Tyrl58His或 Vall76化e的置换的突变体，但除了前述特定位点中的氨基酸置换W外，也可W含有运些氨 基酸置换。
[0092] 需要说明的是，通过进行氨基酸置换来制备本发明的化结合性蛋白质时，对于特 定位点的氨基酸残基，只要具有抗体结合活性，也可W置换为前述的氨基酸W外的氨基酸。 作为其一例，可列举出保守的置换即两氨基酸的物理性质和化学性质或者其一类似的氨基 酸间进行置换。对于本领域技术人员来说已知的是，保守的置换不限定于化结合性蛋白质， 通常在产生置换的蛋白质与没有产生置换的蛋白质之间维持了蛋白质的功能。作为保守的 置换的一例，可列举出甘氨酸与丙氨酸之间、天冬氨酸与谷氨酸之间、丝氨酸与脯氨酸之 间、或者谷氨酸与丙氨酸之间产生的置换（蛋白质的结构和功能，MEDICAL SCIENCES INTERNATIONA^LTD. ,9,2005)。
[0093] 本发明的化结合性蛋白质中，对于置换的氨基酸的个数没有特别的限制。作为一 例，可列举出W下的（a)至化)所示的Fc结合性蛋白质。运些Fc结合性蛋白质从对热和酸的 稳定性提高的观点出而优选。（a)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为 止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu和Tyr35Asn 的氨基酸置换的化结合性蛋白质(包含序列号27中记载的氨基酸序列中第33位至第208位 为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质）。化)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至 第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生化127G1U、 Tyr35Asn和化e7化eu的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号31中记载的氨基酸序列 中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合性蛋白质）。山)包含序列号1中记载的氨基 酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基 中产生Val27Glu、Tyr35Asn、化e7化eu和Glul21Gly的氨基酸置换的化结合性蛋白质（包含 序列号33中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合性蛋白质）。 (d)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17 位至第192位为止的氨基酸残基中产生了 ￥曰1276111、了7'354311、？}167化611、43119256'和 Glul21Gly的氨基酸置换的化结合性蛋白质(包含序列号37中记载的氨基酸序列中第33位 至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质）。（6)包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生 化127Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu和Glul21Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质（包 含序列号41中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白 质）。（門包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该 第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、 Asn92Ser和Glul21Gly的氨基酸置换的化结合性蛋白质（包含序列号43中记载的氨基酸序 列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合性蛋白质）。（旨)包含序列号1中记载的氨 基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残 基中产生 ￥曰1276111、了7切54311、611154439、？}16751^611、6111120化1和6111121617的氨基酸置换 的Fc结合性蛋白质（包含序列号47中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸 序列的化结合性蛋白质）。化饱含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的 氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、 611154439、？}16751^611、43119256'、6111120￥日1和6111121617的氨基酸置换的。。结合性蛋白质 (包含序列号49中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合