[0249]
[0250] 实施例6改良化结合性蛋白质的酸稳定性评价
[0251] (1)按照与实施例5(1)至(5)同样的方法制备改良化结合性蛋白质。
[0252] (2)W各蛋白质的浓度成为30yg/mL的方式用包含150mM氯化钢的20mM的化is缓冲 液(pH7.4)进行稀释。将稀释的各Fc结合性蛋白质60化和0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0) 120化混合，在30°C下静置2小时。
[0253] (3)利用实施例3(4)中记载的化ISA法，对利用甘氨酸盐酸缓冲液(PH3.0)进行酸 处理后的蛋白质的抗体结合活性、和没有进行前述酸处理时的蛋白质的抗体结合活性进行 测定。之后，将进行了酸处理后的抗体结合活性除W没有进行酸处理时的抗体结合活性，由 此计算出残留活性。
[0254] 将结果示于表9。此次评价的突变型的化结合性蛋白质（FcR2、FcR3、FcR4JcR5a、 尸。尺56少。1?6曰、化1?613少。1?7)与野生型。(3结合性蛋白质相比较，残留活性变高，确认该突变型 的Fc结合性蛋白质的酸稳定性提高。
[ο 巧 5][表 9]
[Ο 巧 6]
[0257] 实施例7进行了 1位点氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的制备
[0258] 对于实施例3中已经明确的、设及化结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中 的序列号1的第27位的鄉氨酸(Val)、第35位的酪氨酸(Tyr)和第121位的谷氨酸(Glu)置换 成其他氨基酸的Fc结合性蛋白质，分别用下述的方法进行制备。
[0259] (A)将序列号1的第27位的鄉氨酸(化1)置换成其他氨基酸的化结合性蛋白质的制 备
[0260] (A-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号51 (5 ' - CTGCCGAAAGCGNNKGTGTTTCTGGAACCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为27pF。
[0261] (A-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号52(5'- TTCCAGAAACACMNNCGCTTTCGGCAGATC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为27pR。
[0262] (A-3)将(A-1)和(A-2)中得到的巧帕CR产物(27pF、27pR)进行混合之后，按照与实 施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将27pF和27pR连接。将得到的PCR产物作为27p。
[02创 （A-4)将(A-3)中得到的PCR产物27p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与实施例4(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制备编码 将序列号1的第27位的鄉氨酸置换成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0264] (A-5)对(A-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0265] (A-6)对得到的转化体用添加了50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的 菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核巧酸序列解析。
[0%6]结果，得到编码产生了 Val27Gly(V27G)、Val27Lys(V27K)、Val27Thr(V27T)、 化127Ala(V27A)、化127T巧(V27W)或化127Arg(V27R)的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多 聚核巧酸。
[0267] (B)将序列号1的第35位酪氨酸(Tyr)置换成其他氨基酸的化结合性蛋白质的制备
[0268] (B-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号53(5'- AACCGCAGTGGNNKCGCGTGCTGGAGAAAG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为35pF。
[0269] (B-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号54(5'- AGCACGCGMNNCCACTGCGGTTCCAGAAAC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为35pR。
[0270] (B-3)将(B-1)和(B-2)中得到的巧帕CR产物(35pF、35pR)进行混合之后，按照与实 施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将35pF和35pR连接。将得到的PCR产物作为35p。
[0271] (B-4)将(B-3)中得到的PCR产物35p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与实施例4(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制备编码 将序列号1的第35位的酪氨酸置换成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0272] (B-5)对(B-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0273] (B-6)对得到的转化体用添加了50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的 菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核巧酸序列解析。
[0274] 结果，得到编码产生了Tyr35Cys(Y35C)、Tyr35Asp(Y35D)、Tyr35Phe(Y35F)、 Tyr35Gly(Y35G)、Tyr35Lys(Y35K)、Tyr3化eu(Y35L)、Tyr35Asn(Y35N)、Tyr35Pro(Y35P)、 Tyr35Arg(Y35R)、Tyr35Ser(Y35S) 'TyrfST'虹（Y35T)、Tyr35化 1 (Y35V)或Tyr35T巧（Y35W)的 氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0275] (C)将序列号1的第121位的谷氨酸(Glu)置换成其他氨基酸的化结合性蛋白质的 制备
[0276] (C-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号55(5'- GTGTTCAAAGAGNNKGATCCGATTCATCTG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为mpF。
[0277] (C-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号56(5'- AATCGGATCMNNCTCTTTGAACACCCACCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4的(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为mpR。
[027引（C-3)将(C-1)和(C-2)中得到的巧tPCR产物（12 IpF、121pR)进行混合之后，按照与 实施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将mpF和mpR连接。将得到的PCR产物作为121ρ。
[0279] (C-4)将(C-3)中得到的PCR产物121ρ作为模板、将具有序列号23和序列号24中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，进行与实施例4(a-4)同样的PCR。由此，制备编码序列号 1的第121位的谷氨酸置换成任意的氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0280] (C-5)对(C-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和化ndllI进行 消化，与预先用限制酶化01和化nd IΠ 消化的表达载体祀TMa化（日本特开2011 -206046号公 报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0281] (C-6)对得到的转化体用添加了50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的 菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核巧酸序列解析。
[0282] 结果，得到编码产生了Glul21Lys 化121K)、Glul21Pr〇ai21P)、Glul21Arg 化 121R)、Glul21Gly 化 121G)、Glul21His 化 121H)或 GI11I2I 化 KE121V)氨基酸置换的 Fc 结合 性蛋白质的多聚核巧酸。
[0283] 实施例8进行了 1个氨基酸置换的化结合性蛋白质的抗体结合活性评价
[0284] (1)对于表达实施例1中制备的野生型Fc结合性蛋白质和实施例7中制备的进行了 1个位点氨基酸置换的化结合性蛋白质的转化体，按照与实施例3(1)和(2)同样的方法分别 进行培养，使野生型Fc结合性蛋白质W及进行了 1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质表达。
[0285] (2)对于表达的进行了 1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质，按照与实施例3(4)中记 载的化ISA法检查与抗体的结合活性。
[0286] 将结果示于图2。通过将序列号1的第27位的鄉氨酸置换成甘氨酸(V27G)、赖氨酸 (V27K)、苏氨酸(V27T)、丙氨酸(V27A)、精氨酸(V27R)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗 体结合活性提高，另一方面，序列号1的第27位的化1置换成色氨酸(V27W)时，与野生型化结 合性蛋白质相比较，抗体结合活性降低。
[0287] 通过将序列号1的第35位的酪氨酸置换成天冬氨酸(Y35D)、苯丙氨酸(Y35F)、甘氨 酸(Y35G)、赖氨酸(Y35K)、亮氨酸(Y35L)、天冬酷胺(Y35N)、脯氨酸(Y35P)、丝氨酸(Y35S)、 苏氨酸(Y35T)、鄉氨酸(Y35V)、色氨酸(Y35W)置换，与野生型化结合性蛋白质相比较，抗体 结合活性提高。其中，Y35D、Y35G、Y35K、Y3化、Y35N、Y35P、Y35S、Y35T、Y35W与野生型化结合 性蛋白质相比较，抗体结合活性大幅地提高。另一方面，将序列号1的第35位的酪氨酸置换 成半脫氨酸(Y35C)、精氨酸(Y35R)的情况下，为与野生型化结合性蛋白质几乎同等的抗体 结合活性。
[0288] 通过将序列号1的第121位的谷氨酸置换成赖氨酸化12化）、精氨酸化121R)、甘氨 酸化121G)、组氨酸化121H)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性提高。其中， E121G与野生型化结合性蛋白质相比较，抗体结合活性大幅地提高。另一方面，将序列号1的 第121位的谷氨酸置换成鄉氨酸化121V)的情况下，是与野生型Fc结合性蛋白质几乎同等的 抗体结合活性;置换成脯氨酸化121P)的情况下，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结 合活性降低。
[0289] 实施例9进行了 1个氨基酸置换化结合性蛋白质的热稳定性评价
[0290] 为了对实施例8中评价的进行了 1个氨基酸置换的化结合性蛋白质的热稳定性进 行比较，按照与实施例3(3)同样的方法进行热处理(45°C、10分钟），计算出残留活性。
[0291] 将结果示于图3。将序列号1的第35位的酪氨酸分别置换为天冬氨酸(Y35D)、甘氨 酸(Y35G)、赖氨酸(Y35K)、亮氨酸(Y35L)、天冬酷胺(Y35N)、脯氨酸(Y35P)、丝氨酸(Y35S)、 苏氨酸（Y35T)的Fc结合性蛋白质，W及将序列号1的第121位的谷氨酸置换成甘氨酸 化121G)的化结合性蛋白质，与野生型化结合性蛋白质相比较热稳定性大幅地提高。其中， Y35N、Y35P与野生型Fc结合性蛋白质相比较，热稳定性大幅地提高。
[0292] 实施例10 FcR5a的大量制备
[0293] (1)将实施例4(c)中制备的表达FcR5a的转化体接种至加入至化的Ξ角瓶的包含 50yg/mL卡那霉素的400mL的2YT液体培养基(蛋白腺16g/L、酵母提取物lOg/L、氯化钢5g/L) 中，在37°C下好氧地振荡培养一晚，从而进行前培养。
[0294] (2)向包含葡萄糖lOg/L、酵母提取物20g/L、憐酸Ξ钢十二水合物3g/L、憐酸氨二 钢十二水合物9g/L、氯化锭Ig/L和硫酸卡那霉素50mg/L的液体培养基1.化中接种（1)的培 养液180mL，使用化发酵罐（Biott Corporation制）进行主培养。设定溫度30°C、pH6.9至 7.1、通气量1VVM、溶解氧浓度30 %饱和浓度的条件，开始主培养。为了控制抑，分别地，作为 酸使用50%憐酸、作为碱使用14%氨水，溶解氧的控制通过使揽拌速度变化来进行控制，揽 拌转速设定为下限5(Κ)巧m、上限lOOOrpm。培养开始后，在葡萄糖浓度变得不能测定的时点， 一边通过溶解氧(DO)进行控制一边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/ L、硫酸儀屯水合物7.2g/L)。
[0295] (3)作为菌体量的目标，600nm的吸光度(0D600nm)到达约150时，将培养溫度下降 至25°C，确认到达设定溫度之后，添加 IPTGW使终浓度成为0.5mM，接着在25°C下继续培养。
[0296] (4)在培养开始约48小时后停止培养，对培养液在4°C下进行8000巧m、20分钟的离 屯、分离，由此回收菌体。
[0297] (5)将(4)中回收的菌体的一部分用包含150mM氯化钢的20mM的Tris盐酸缓冲液 (抑7.4)W成为5mL/lg(菌体）的方式悬浊，使用超声波发生装置（Insoneta201M(商品名）、 久保田商事制），在4°C下W约10分钟、约150W的功率对菌体进行破碎。对于菌体破碎液，在4 °C下进行2次20分钟、lOOOOrpm的离屯、分离，回收上清。
[0298] (6)对(5)中得到的破碎液W终浓度成为20mM的方式添加咪挫之后，施加于预先用 包含150mM的氯化钢和20mM咪挫的20mM的Tris盐酸缓冲液（PH7.4)平衡化的填充了 Ni S邱harose 6Fast Flow(GE Healthcare制）50血的XK 26/20柱（GE Healthcare制）。用平衡 化中使用的缓冲液进行洗涂之后，使用包含150mM氯化钢和0.5M咪挫的20mM的化iS盐酸缓 冲液(PH7.4)洗脱 FcR5a。
[0299] (7)将(6)中得到的洗脱液施加于预先用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲 液（PH7.4)平衡化的填充了 IgG琼脂糖凝胶（GE Healthcare制）30mL的HR 16/10柱（GE 化althcare制）。用平衡化中使用的缓冲液进行洗涂之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液 (pH3.0)洗脱FcR5a。需要说明的是，洗脱液通过加入洗脱液量的1/4量1M化is盐酸缓冲液 (抑7.0)而使抑恢复至中性附近。
[0300] 实施例11 FcR5a固定化凝胶的制备
[0301 ] (1)对实施例 10制备的FcRf5a 使用超滤膜(Mill ipore Corporation制：Ami con 叫化al5)进行浓缩?缓冲液交换，用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲液(pH7.4)浓 缩至8.37mg/mL的浓度。
[0302] (2)使作为载体的亲水性乙締基聚合物(TOSOH CORPORATION制：T0Y0PEA化）的径 基与1，6-己二醇二缩水甘油基酸反应来制备环氧基T0Y0PEA化凝胶。
[0303] (3)准备5根（2)中制备的加入了环氧基TOY0PEA化凝胶100化的吸附柱（SPiη column;Bi〇-Rad Laboratories, Inc.制），用包含0.5Μ氯化钢的0.1 M的棚酸缓冲液(ρΗ9.0) 〇.5mL洗涂3次。
[0304] (4)将（1)中制备的FcR5a溶液0.3mL与包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲液 (抑9.0)0.45mL混合，将混合溶液分别添加至（3)中记载的填充了凝胶的吸附柱，35°C下振 荡3小时。
[0305] (5)对向凝胶中加入的化貼a溶液与包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲液的混合 溶液进行回收之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)0.2mL洗涂3次。之后，通过用包含 150mM氯化钢的20mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)0.5mL洗涂3次使抑恢复至中性附近，从而制备 FcR5a固定化凝胶0.5mL。
[0306] 对于(5)中回收的溶液W及洗涂液中所包含的蛋白质浓度进行测定，计算出固定 化于凝胶的化貼曰的量，从而计算出固定化率，添加的化貼a的33.7 %固定化于凝胶。
[0307] 实施例12用化貼a固定化凝胶的抗体分离
[0308] (1)将实施例11中制备的化贴a固定化凝胶0.5mL填充于皿16/5柱(GE Healthcare 制），与AKTAprime plus(GE Healthcare制）相连接。之后，用包含150mM氯化钢的SOmMTris 盐酸缓冲液(pH7.4)进行平衡化。
[0309 ] (2)使包含150mM氯化钢的20mM的Tr i S盐酸缓冲液(pH7.4) W 0.1血的流速流动，用 包含150mM氯化钢的SOmMTris盐酸缓冲液(pH7.4)施加制备成Img/mL的人IgGl(Sigma公司 制：15154-1MG)溶液0.5mL，使人IgG 1吸附于化R5a固定化凝胶。之后，通过流过20mM乙酸缓 冲液(P册.0)进行平衡化，利用20mM的甘氨酸盐酸缓冲液(PH3.0)带来的抑梯度对吸附的人 IgGl进行洗脱。洗脱的人IgGl每0.5mL回收级分。
[0310] 将人IgGl的洗脱模式和回收的级分示于图4中。回收的洗脱级分中，将级分13 (化13)和级分14(Frl4)混合而成的物质称为级分A(FrA);将级分16(Frl6)和级分17(化17) 混合而成的物质称为级分B(化B)。
[0311] 实施例13分离抗体的糖链结构解析
[0312 ] (1)对实施例12中使用的纯化前的人I gG 1和洗脱级分(化A、FrB)利用100°C、10分 钟的热处理进行变性之后，用糖酷胺酶A/胃蛋白酶和链霉蛋白酶依次进行处理，经过利用 凝胶过滤法的纯化操作，取得糖链级分。
[0313] (2)将（1)中得到的糖链用蒸发器进行浓缩?干燥之后，在乙酸溶剂下使2-氨基化 晚、接着使二甲胺棚烧依次作用而制成巧光标记化糖链，利用凝胶过滤法进行纯化。
[0314] (3)对于（2)中得到的巧光标记化糖链用阴离子交换柱（TSKgel DEAE-5PW、Φ 7.5mm X 7.5cm: TOSOH CORPORATION制)分离成中性糖链级分和单唾液酸巧化糖链级分。
[0315] (4)对于(3)中得到的中性糖链级分和单唾液酸巧化糖链级分使用0DS柱分离成各 个糖链。通过MALDI-T0F-MS分析得到分离的糖链的分子量信息之后，对照0DS柱色谱的保留 时间（retention time)，匹配糖链结构。
[0316] 将中性糖链的组成比示于表10中，将单唾液酸巧化糖链的组成比示于表11中。另 夕h将匹配的糖链结构(N1至N8W及Ml至M2)示于图5。由表10所示的结果可知，具有糖链结 构N2和N7的抗体在纯化前W及在FrB中被检测出，但没有从FrA中被检测到。即，具有前述2 种糖链结构（图5的N2和N7)的抗体在作为早洗脱级分的FrA中没有被检测出，而在作为迟洗 脱级分的FrB中被检测出，因此表明与具有其他糖链结构的抗体相比较，与FcR5a固定化凝 胶强结合。由W上的结果可知，作为本发明的吸附剂的一形式的FcR5a固定化凝胶能够根据 抗体所具有的糖链结构的差异而分离出抗体。
[0引7][表 10]
[0321] 实施例14用化Rf5a固定化凝胶的抗体纯化
[0322] 使用实施例11中制备的化貼a固定化凝胶进行人IgGl和人IgG3的纯化。
[0；3Z3] (1)用与实施例11同样的方法制备化R5a固定化凝胶0.2血。将制备的化R5a固定化 凝胶O.lmL填充于吸附柱。
[0324] (2)将（1)中制备的填充了FcR5a固定化凝胶的柱用包含150mM氯化钢的20mM的 Tris盐酸缓冲液(pH7.4)0.5mL洗涂3次。
[0325] (3)对作为动物细胞用培养基的DMEM/F12培养基（Thermo Fisher Scientific Inc.制）中添加了 10%胎牛血清(FCS)的培养基，添加人IgGl(Sigma-Al化ich Co丄LC.制： I5154-1M