G)或人IgG3(Sigma-Al化ich Co丄LC.制：I4639-1MG)W成为0.3mg/mL，从而制备 模拟培养液。
[0326] (4)对(2)中洗涂的柱加入(3)中制备的模拟培养液0.4mL，25°C下进行2小时振荡。
[0327] (5)去除模拟培养液，用包含150mM氯化钢的20mM的Tr i S盐酸缓冲液(pH7.4) 0.5mL 洗涂4次之后，用5(Κ)化的0.1 M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行洗脱，每1(Κ)化回收级分。
[0328] (6)对模拟培养液、洗脱级分分别添加2 X样品缓冲液(包含2 (w/v) %十二烷基硫 酸钢、6(>八）％0-琉基乙醇、1〇(>八）％甘油和〇.〇〇5(￥八）％漠酪蓝的5〇11^的化13盐酸缓冲 液（PH6.8))进行加热处理。之后，对处理的样品用使用了 5至20%梯度SDS-PAGE用凝胶 (ATT0 Corporation.制）的电泳进行分离。需要说明的是，作为比较，对于模拟培养液中添 加的人IgGl和人IgG3(浓度:0.2mg/mU也进行同样的处理，用SDS-PAGE进行分析。
[0329] 将包含人IgGl或人IgG3的洗脱级分的利用SDS-PAGE的分析结果示于图6。对添加 了人IgGl的模拟培养液进行纯化而得到的包含人IgGl的洗脱级分，显示出与模拟培养液中 所添加的人IgGl同样的位置，并且看不到模拟培养液中所看到的白蛋白的条带，所W能够 确认对人IgGl进行了高纯度地纯化（图6的(A))。另外，对添加了人IgG3的模拟培养液进行 纯化而得到的包含人IgG3的洗脱级分，显示出与模拟培养液中所添加的人IgG3同样的位 置，并且看不到模拟培养液中所看到的白蛋白的条带，所W能够确认对人IgG3进行了高纯 度地纯化（图6的(B))。由运些结果可知，作为本发明吸附剂的一形式的FcR5a固定化凝胶能 够从动物细胞用的培养液中纯化人IgGl和人IgG3。
[0330] 实施例15去除了糖链的人IgGl的制备
[0331] 用W下所示的方法进行从人IgGl中N型糖链的去除。
[0332] (1)W人IgGUFitzgerald公司制：31-AI17)的浓度成为3mg/mL的方式用包含 150mM氯化钢的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)进行稀释。
[0333] (2)向（1)的稀释液100化中加入1M的Tris盐酸缓冲液（ρΗ8.6)100^，加入N- glycosidase F巧00mU/yL(TAKARABI0 INC.制:4450) 10化之后，在37°C下静置24小时，从而 去除IgGl的N型糖链。
[0334] (3)对预先用包含150mM氯化钢的20mMTris盐酸缓冲液(PH7.4)平衡化的填充了 Toyopearl AF-rProtein A-650F(T0S0H CORPORATION制：22803) 100化的开放柱（Bio-Rad Laboratories, Inc.制）施加（2)的处理液。
[0335] (4)用50化L的包含150mM氯化钢的20mM化is盐酸缓冲液(PH7.4)洗涂3次之后，用 100化的0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱7次，由此对去除了N型糖链的人IgGlm下，简 单地称为去除了糖链的人IgGl)进行纯化。需要说明的是，对该洗脱液通过加入洗脱液的1/ 4量的1M的化is盐酸缓冲液(P册.0)进行中和。
[0336] (5)对于(4)中得到的去除了糖链的人IgGl溶液添加等量的样品缓冲液(包含2(w/ V) %十二烷基硫酸钢、6(w/v) %β-琉基乙醇、10(w/v) %甘油和0.005(w/v) %漠酪蓝的50mM 的Tris盐酸缓冲液(P册.8))进行加热处理，对去除了糖链的人IgGl进行还原处理。
[0337] (6)利用使用了5至20%梯度SDS-PAGE用凝胶(ATT0 Corporation.制）的电泳对人 IgGl进行分离。需要说明的是，作为比较，对于没有进行糖链处理的人IgGUW下，称为有糖 链的人I gG 1)水溶液(浓度:0.5mg/mL)也进行与（5)的记载同样的还原处理，用SDS-PAGE进 行分离。
[0338] 将结果示于图7。通过SDS-PAGE能够确认的是，由于去除了糖链的人IgGl的重链被 去除了N型糖链，因此与有糖链的人IgGl的重链相比较，变为低分子量的（参照图7的泳道 (2))。即，可W确认，用本实施例的方法能够制备去除了N型糖链的人IgGl。
[0339] 实施例16人化丫 Rllla的大量制备
[0340] (1)将能够表达实施例1中得到的人Fc 丫 Rllla的转化体接种于加入至化的Ξ角瓶 中的包含50yg/mL卡那霉素的400mL的2YT液体培养基（蛋白腺16g/L、酵母提取物lOg/L、氯 化钢5g/L)，在37°C下好氧地振荡培养一晚，由此进行前培养。
[0%1] (2)向包含葡萄糖lOg/L、酵母提取物20g/L、憐酸Ξ钢十二水合物3g/L、憐酸氨二 钢十二水合物9g/L、氯化锭Ig/L和硫酸卡那霉素50mg/L的液体培养基1.化中接种（1)的培 养液180mL，使用化发酵罐进行主培养。设定溫度30°C、pH6.9至7.1、通气量1VVM、溶解氧浓 度30%饱和浓度的条件，开始主培养。为了控制抑，分别地，作为酸使用50%憐酸、作为碱使 用14%氨水，溶解氧的控制通过使揽拌速度变化来进行控制，揽拌转速设定为下限50化pm、 上限lOOOrpm。培养开始后，在葡萄糖浓度变得不能测定的时点，一边通过溶解氧(DO)进行 控制一边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/L、硫酸儀屯水合物7.2g/ Do
[CX342] (3)作为菌体量的目标，600nm的吸光度(0D600nm)到达约150时，将培养溫度下降 至25°C，确认到达设定溫度之后，添加 IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖巧使终浓度成为 0.5mM，接着在25°C下继续培养。
[0343] (4)在培养开始约48小时后停止培养，对培养液进行8000巧m、20分钟的离屯、分离， 由此回收菌体。
[0344] (5)将(4)中回收的菌体用包含150mM氯化钢的20mM的化i S盐酸缓冲液(pH7.4似 成为5mL/lg(菌体)的方式悬浊，使用超声波发生装置(Insoneta201M(商品名）、久保田商事 制），在4°C下W约10分钟、约150W的功率对菌体进行破碎。对于菌体破碎液，在4°C下进行2 次20分钟、10000巧m的离屯、分离，回收上清。
[0345] (6)对(5)中得到的破碎液W终浓度成为20mM的方式添加咪挫之后，施加于预先用 包含150mM的氯化钢和20mM咪挫的20mM的Tris盐酸缓冲液（PH7.4)平衡化的填充了 Ni Sepharose 6化31 Flow(GE Healthcare制）50mL的XK 26/20柱（GE Healthcare制）。
[0346] (7)用平衡化中使用的缓冲液进行洗涂之后，使用包含150mM氯化钢和0.5M咪挫的 20mM的化is盐酸缓冲液(pH7.4)洗脱人Fc 丫 Rllla。
[0347] (8)将(7)中得到的洗脱液施加于预先用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲 液（PH7.4)平衡化的填充了 IgG琼脂糖凝胶（GE Healthcare制）10mL的HR 16/10柱（GE 化althcare制）。用平衡化中使用的缓冲液进行洗涂之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液 (抑3.0)洗脱人化丫 RIIla。需要说明的是，洗脱液通过加入洗脱液量的1/4量1M化iS盐酸 缓冲液(P册.0)而使pH恢复至中性附近。
[0%引实施例17对人化丫 Rllla的抗体的结合性测定
[0349] (1)对实施例16中制备的人Fc 丫 Rllla用憐酸缓冲液(包含137mM的化CK8.1M的 Na2HP04、2.68mM的KC巧日1.47mM的K出Κ)4的pH7.4的缓冲液)进行透析来进行缓冲液交换，由 280nm的吸光度测定人Fc 丫 Rllla的浓度。
[0350] (2)将（1)中测定了浓度的人化丫 Rllla用20mM的乙酸缓冲液(P册.5)稀释至lOyg/ mL之后，使用胺偶联试剂盒(GE化althcare制）固定化于传感器忍片（Sensor化ip)CM5(GE Healthcare制），使用Biacore T-100(GE Healthcare制）对人化 丫 RIIla固定化量进行测 定。结果，人。(3丫1?111曰的固定化量为488.2抓（1抓=1口邑/1111112)。另外，对于蛋白4。1'〇16齡￥曰 Co.，Ltd.制）也同样地，用20mM的乙酸缓冲液（PH5.5)稀释至lOyg/mL，固定化于CM5(GE Healthcare制）。用Biacore T-100测定固定化量的结果，固定化量为290.0RU。
[0351] (3)将具有糖链的人IgGlW及实施例15中制备的去除了糖链的人IgGl用皿S-EP (+ )(包含lOmM的皿PES、150mM的化C1、3mM的抓TA和0.005(v/v) % 的SuWactant P20(GE Hea 1 thcar e制）的抑7.4的溶液）稀释至12祉g/血、6化g/mL、3化g/血、1化g/mL、祉g/mL、化g/ mL、2μ邑/mL、1μ邑/mL。
[0352] (4) (2)中制备的蛋白质固定化忍片中，人Fc 丫 RIIla固定化忍片的情况下，使化g/ mL至12祉g/mL的具有糖链的人IgGl或去除了糖链的人IgGl W流速30化/分钟流动;蛋白A固 定化忍片的情况下，使lyg/mL至16yg/mL的具有糖链的人IgGl或去除了糖链的人IgGlW流 速30化/分钟流动，使人IgGl与固定化于忍片的蛋白质结合之后，用Biacore T-100W接触 时间210秒、解离时间400秒的条件进行测定，从而测定人IgGl与固定化于忍片的蛋白质的 结合性。
[0353]将测定结果示于图8。可知，人Fc 丫 Rllla对于具有糖链的人IgGl具有结合性，而对 于去除了糖链的人IgGl则非常难W结合(参照图8(A))。即，由该结果可知，人化yRIIIa识 别由糖链对于抗体的附加导致的差异。另一方面，可知蛋白A无论糖链的有/无而对人IgGl 具有同样的结合性(参照图8(B))。
[0354]实施例18人Fc 丫 Rllla固定化凝胶的制备
[03巧](1)对实施例16中制备的人化丫 Rllla使用超滤膜(Millipore Corporation制： Amicon叫化al5)进行浓缩?缓冲液交换，用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲液 (pH7.4)浓缩至2.6mg/mL的浓度为止。 惦56] (2)使作为载体的亲水性乙締基聚合物(TOSOH CORPORATION制：T0Y0PEA化）的径 基与1，6-己二醇二缩水甘油基酸反应来制备环氧基T0Y0PEA化凝胶。
[Ο%7] (3)将（2)中制备的环氧基T0Y0PEARL凝胶70化加入至吸附柱（Bio-Rad Laboratories，Inc .)，用包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲液(pH9.0)0.5mL洗涂3次。
[0358] (4)将（1)中制备的人化丫 Rllla溶液0.4mL与包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲 液(pH9.0)0.6mL混合，将该混合溶液添加至(2)的凝胶中，35°C下进行3小时振荡。
[0359] (5)将(4)中制备的凝胶用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(P册.0)0.2mL洗涂3次之后， 用包含150mM氯化钢的20mM的Tri S盐酸缓冲液(pH7.4)0.5血洗涂3次，由此使抑恢复至中性 附近，从而制备人化丫 RIIIa固定化凝胶0.2mL。
[0360] (6)对向（2)的凝胶中所添加的溶液和洗涂液中所包含的蛋白质浓度进行测定，计 算出固定化于凝胶的人化丫 Rllla量，从而计算固定化率，结果添加的人化丫 Rllla的84% 被固定化于凝胶。
[0361] 实施例19使用了人化丫 Rllla固定化凝胶的抗体分离
[0362] (1)将实施例18中制备的人Fc 丫 Rllla固定化凝胶填充于HR16/5柱（GE Healthcare制），将该柱与液相色谱法装置AKTAp;rime(GE Healthcare制）连接。
[0363] (2)对（1)中制备的柱用包含150mM氯化钢的20mM的化iS盐酸缓冲液(pH7.4)进行 平衡化，W流速0.1 mL/min添加0.1 mL人IgGl (Fitzgerald公司制：31-AI17)或实施例2中制 备的去除了糖链的人IgGl(溶液浓度均为Img/mL)。用平衡化中所使用的缓冲液进行洗涂之 后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.5)进行洗脱。
[0364] 将结果示于图9。可W确认，尽管流过了等量的IgGl,去除了糖链的人IgGl(参照图 9的（2))与具有糖链的人IgGl(参照图9的（1))相比较，没有吸附于凝胶而通过的抗体量多。 另外，具有糖链的人IgGl中添加了0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.5)时，抗体被洗脱了（参照 图9的（1))，而去除了糖链的人IgGl几乎没有吸附于凝胶，所W抗体没有被洗脱(参照图9的 (2))。即，将人Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的吸附剂具有能够特异地吸附具有糖 链的抗体的性能，通过利用该性能能够识别糖链有无附加于抗体。
[0365] 产业上的可利用性
[0366] 本发明的吸附剂特异地吸附具有糖链的抗体，因此能够高纯度地分离.纯化具有 糖链的抗体。因此，本发明的吸附剂可应用于抗体药物制造和品质管理。
【主权项】
1. 一种Fc结合性蛋白质，其包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止 的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生以下的（1)至(40)中至少 任一种氨基酸置换； (1) 序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸 (2) 序列号1的第27位的缬氨酸置换为谷氨酸 (3) 序列号1的第29位的苯丙氨酸置换为亮氨酸或丝氨酸 (4) 序列号1的第30位的亮氨酸置换为谷氨酰胺 (5) 序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯 氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的任一者 (6) 序列号1的第46位的赖氨酸置换为异亮氨酸或苏氨酸 (7) 序列号1的第48位的谷氨酰胺置换为组氨酸或亮氨酸 (8) 序列号1的第50位的丙氨酸置换为组氨酸 (9) 序列号1的第51位的酪氨酸置换为天冬氨酸或组氨酸 (10) 序列号1的第54位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸 (11) 序列号1的第56位的天冬酰胺置换为苏氨酸 (12) 序列号1的第59位的谷氨酰胺置换为精氨酸 (13) 序列号1的第61位的苯丙氨酸置换为酪氨酸 (14) 序列号1的第64位的谷氨酸置换为天冬氨酸 (15) 序列号1的第65位的丝氨酸置换为精氨酸 (16) 序列号1的第71位的丙氨酸置换为天冬氨酸 (17) 序列号1的第75位的苯丙氨酸置换为亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸的任一者 (18) 序列号1的第77位的天冬氨酸置换为天冬酰胺 (19) 序列号1的第78位的丙氨酸置换为丝氨酸 (20) 序列号1的第82位的天冬氨酸置换为谷氨酸或缬氨酸 (21) 序列号1的第90位的谷氨酰胺置换为精氨酸 (22) 序列号1的第92位的天冬酰胺置换为丝氨酸 (23) 序列号1的第93位的亮氨酸置换为精氨酸或甲硫氨酸 (24) 序列号1的第95位的苏氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸 (25) 序列号1的第110位的亮氨酸置换为谷氨酰胺 (26) 序列号1的第115位的精氨酸置换为谷氨酰胺 (27) 序列号1的第116位的色氨酸置换为亮氨酸 (28) 序列号1的第118位的苯丙氨酸置换为酪氨酸 (29) 序列号1的第119位的赖氨酸置换为谷氨酸 (30) 序列号1的第120位的谷氨酸置换为缬氨酸 (31) 序列号1的第121位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸 (32) 序列号1的第151位的苯丙氨酸置换为丝氨酸或酪氨酸 (33) 序列号1的第155位的丝氨酸置换为苏氨酸 (34) 序列号1的第163位的苏氨酸置换为丝氨酸 (35) 序列号1的第167位的丝氨酸置换为甘氨酸 (36) 序列号1的第169位的丝氨酸置换为甘氨酸 (37) 序列号1的第171位的苯丙氨酸置换为酪氨酸 (38) 序列号1的第180位的天冬酰胺置换为赖氨酸、丝氨酸、异亮氨酸的任一者 (39) 序列号1的第185位的苏氨酸置换为丝氨酸 (40) 序列号1的第192位的谷氨酰胺置换为赖氨酸。2. 根据权利要求1所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序 列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、组氨酸的任一者。3. 根据权利要求2所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序 列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬酰胺或脯氨酸。4. 根据权利要求3所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且分别地、该第17位至第192位为止的氨基酸残基 中至少第27位的缬氨酸置换为谷氨酸、第35位的酪氨酸置换为天冬酰胺。5. 根据权利要求4所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列中第33位至 第208位为止的氨基酸残基。6. 根据权利要求5所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列。7. 根据权利要求1至6的任一项所述的Fc结合性蛋白质，进一步产生以下的(41)至(44) 中至少任一个氨基酸置换；（41)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸，（42)序 列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸，（43)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨 酸，（44)序列号1的第176位的缬氨酸置换为苯丙氨酸。8. -种吸附剂，其是将权利要求1至7的任一项所述的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性 载体而得到的。9. 一种抗体的纯化方法，其使用了权利要求8所述的吸附剂。10. -种具有糖链的抗体的纯化方法，其包括： 将包含具有糖链的抗体的溶液添加至权利要求8所述的吸附剂中并使该具有糖链的抗 体吸附于该吸附剂的工序;和 使用洗脱液将吸附于所述吸附剂的具有糖链的抗体洗脱的工序。11. 一种识别方法，其通过使用权利要求8所述的吸附剂分离抗体，从而识别抗体所具 有的糖链结构的差异。12. -种抗体，其是用权利要求9或10所述的纯化方法得到的。13. -种糖链的分离方法，其使用了权利要求8所述的吸附剂。14. 一种糖链，其是用权利要求13所述的分离方法得到的。15. -种多聚核苷酸，其编码权利要求1至7的任一项所述的Fc结合性蛋白质。16. -种表达载体，其包含权利要求15所述的多聚核苷酸。17. -种转化体，其是以权利要求16所述的表达载体转化宿主而得到的。18. 根据权利要求17所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。19. 一种Fc结合性蛋白质的制造方法，通过对权利要求17或18所述的转化体进行培养 而使Fc结合性蛋白质表达，从培养物中回收表达的Fc结合性蛋白质。
【专利摘要】本发明第一课题在于提供Fc结合性蛋白质的稳定性、特别是对于热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂。进而，第二课题在于提供能够识别对于抗体有无附加糖链的方法以及该方法中使用的材料。通过介由将人FcγRIIIa中的、细胞外区域中特定位点的氨基酸残基置换为其他特定的氨基酸而对于热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂，解决了第一课题。进而，通过使用将人FcγRIIIa固定化于不溶性载体而得到的、能够特异地吸附具有糖链的抗体的吸附剂，解决了第二课题。
【IPC分类】C07K1/22, C12P21/02, C12N1/21, C12N15/09, C07K14/735
【公开号】CN105555801
【申请号】CN201480051782
【发明人】朝冈義晴, 田中亨, 井出辉彦
【申请人】东曹株式会社
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年9月18日
【公告号】EP3048112A1